[发明专利]一种高通量鉴定产生1-脱氧野尻霉素菌株的方法

摘要

本发明公开了一种高通量筛选产生脱氧野尻霉素菌株的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：1)构建表达DNJ生物合成途径的重组载体和表达β‑半乳糖苷酶的出发菌；2)得到相应DNJ合成基因的易错PCR产物；3)以所述相应DNJ合成基因的易错PCR产物为引物，所述重组载体为模板，进行MEGAWHOP PCR，得到MEGAWHOP PCR质粒突变体库；4)将所述MEGAWHOP PCR质粒突变体库转入所述出发菌中，涂平板，得到突变库平板；从所述突变库平板上选取颜色比所述野生菌平板上菌落颜色浅的菌落，即为高产DNJ菌。本发明可以筛选高产DNJ、低产DNJ或者不产DNJ的菌株，提高到了筛选效率，节省时间，简化筛选步骤。

主权项

1.一种高通量鉴定高产或低产或不产脱氧野尻霉素菌株的方法，包括如下步骤：1）构建表达DNJ生物合成途径的重组载体和表达β‑半乳糖苷酶的出发菌；所述表达DNJ生物合成途径的重组载体按照包括如下步骤的方法获得：将3个DNJ合成基因共同插入表达载体中，得到表达DNJ生物合成途径的重组载体；所述3个DNJ合成基因为gabT1基因、yktc1基因和gutB1基因；所述表达β‑半乳糖苷酶的出发菌按照包括如下步骤的方法获得：将表达β‑半乳糖苷酶的基因整合到大肠杆菌染色体上，得到表达β‑半乳糖苷酶的出发菌；所述β‑半乳糖苷酶的基因的核苷酸序列为序列表中的序列2；2）针对任一个所述DNJ合成基因设计易错PCR扩增引物，并以所述重组载体为模板，进行易错PCR扩增，得到相应DNJ合成基因的易错PCR产物；3）以所述相应DNJ合成基因的易错PCR产物为引物，所述重组载体为模板，进行MEGAWHOP PCR，得到MEGAWHOP PCR质粒突变体库；4）将所述MEGAWHOP PCR质粒突变体库转入所述出发菌中，涂平板，得到突变库平板；且将所述重组载体转入所述出发菌中，涂平板，得到野生菌平板；所述平板含有X‑gal；从所述突变库平板上选取颜色比所述野生菌平板上菌落颜色浅的菌落，即为高产DNJ菌；从所述突变库平板上选取颜色比所述野生菌平板上菌落颜色深的菌落，即为低产或不产DNJ菌；所述高产DNJ菌为DNJ产量高于野生型菌的菌；所述低产或不产DNJ菌为DNJ产量低于野生型菌的菌；所述野生型菌为将所述表达DNJ生物合成途径的重组载体导入所述出发菌中，得到的菌。