[发明专利]转RgPAL1基因提高地黄中毛蕊花糖苷含量的方法

摘要

本发明公开了一种转RgPAL1基因提高地黄中毛蕊花糖苷含量的方法，属于生物技术领域。它包括从地黄中克隆基因RgPAL1，构建含RgPAL1的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将RgPAL1转入地黄并再生出植株，PCR检测外源目的基因RgPAL1的整合情况，HPLC‑PDA定量分析转基因地黄中毛蕊花糖苷的含量，筛选获得毛蕊花糖苷含量提高的转基因地黄植株。本发明获得的转基因地黄中毛蕊花糖苷的含量显著提高，转RgPAL1地黄中毛蕊花糖苷的含量是非转化地黄含量的2.57倍，这为利用转基因地黄大规模生产毛蕊花糖苷提供了一种行之有效的方法。本发明为提升毛蕊花糖苷含量提供了创新性和实用性的相关方法和技术。

主权项

转RgPAL1基因提高地黄中毛蕊花糖苷含量的方法，其步骤为：(a)从地黄幼嫩叶片中提取总RNA；(b)将步骤(a)中得到的地黄总RNA反转录获得第一链cDNA，测定cDNA的基因序列后获得地黄RgPAL1基因的编码序列；(c)根据步骤(b)中测定的地黄RgPAL1基因的编码序列设计扩增出完整编码框的引物RgPAL1NSF和RgPAL1NSR，并在引物RgPAL1NSF和RgPAL1NSR上分别引入限制性内切酶位点NcoⅠ和SpeⅠ，然后对RgPAL1基因进行扩增，连接T载体获得pMDTM19‑T‑RgPAL1基因，所述的RgPAL1NSF序列为TGCCATGGCAATGGAGAATGGGCACCAC，所述的RgPAL1NSR序列为GACTAGTCCTAGCAGATAGGGGGAGGTG；(d)以pCAMBIA1305.1为表达载体，用NcoⅠ和SpeⅠ双酶切步骤(c)中得到的pMDTM19‑T‑RgPAL1基因和pCAMBIA1305.1，回收pMDTM19‑T‑RgPAL1基因经酶切后得到的RgPAL1基因片段，将回收的RgPAL1基因片段与酶切后的线性pCAMBIA1305.1连接，转化，获得含RgPAL1基因的植物表达载体；(e)将步骤(d)中获得的含RgPAL1基因的植物表达载体转入根癌农杆菌EHA105中，获得含RgPAL1基因植物表达载体的根癌农杆菌工程菌；(f)将步骤(e)中获得的含RgPAL1基因植物表达载体的根癌农杆菌工程菌介导RgPAL1基因转化地黄叶片外植体，然后按照再生系统的途径培养获得地黄再生植株；(g)利用HPLC‑PDA测定步骤(f)中获得的地黄再生植株中毛蕊花糖苷的含量，筛选获得毛蕊花糖苷含量高的转基因地黄植株。