[发明专利]一种削弱丙酮酸分解代谢强化丙酮酸积累的方法

摘要

本发明公开了一种削弱丙酮酸分解代谢强化丙酮酸积累的方法，属于代谢工程领域。本发明通过过表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶或其保守活性位点突变的突变体，不仅使丙酮酸脱氢酶催化活力下降，削弱丙酮酸经三羧酸循环分解代谢；而且在不致死细胞的前提下，有效强化了丙酮酸的积累。因此，过量表达活性位点突变二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体是一种强化丙酮酸积累的有效手段。

主权项

1.一种丙酮酸积累增强的解脂亚洛酵母重组菌，其特征在于，是通过解脂亚洛酵母中过表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶或保守活性位点发生突变的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶得到；所述二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述保守活性位点发生突变是将第409位 组氨酸突变为丙氨酸，或将第413位 天冬氨酸突变为丙氨酸；构建所述解脂亚洛酵母重组菌的方法，主要包括以下步骤：(1)构建表达目的基因所用的整合型表达载体：扩增潮霉素磷酸转移酶hph基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，利用限制性内切酶Stu I与Hind III同时处理扩增的到的hph基因和p0质粒，并连接两酶切产物得到含有潮霉素磷酸转移酶为筛选标记的整合型表达载体p0(hph)；(2)构建重组整合型表达质粒；根据NCBI公开的序列，全化学合成编码来源于解脂亚洛酵母潮霉素磷酸转移酶编码基因LAT1的开放阅读框序列，分别利用限制性内切酶Bam HI和Eco RI切割LAT1的开放阅读框整合型表达载体p0(hph)，连接获得重组表达质粒p0(hph)‑LAT1；(3)分别设计突变引物对H409A‑F/H409A‑R和D413A‑F/D413A‑R，将LAT1编码的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的第409组氨基酸残基和第413天冬氨酸残基突变为丙氨酸残基，分别获得p0(hph)‑409A和p0(hph)‑413A整合性质粒；(4)将所得的p0(hph)‑LAT1、p0(hph)‑409A和p0(hph)‑413A质粒转化Y.lipolytica WSH‑Z06：利用电穿孔转化法将被限定内切酶Avr II线性化的重组整合型质粒转化野生型Y.lipolytica WSH‑Z06，验证筛选阳性转化子，分别获得Y.lipolytica‑K、Y.lipolytica‑409A和Y.lipolytica‑413A菌株。