[发明专利]一种以硅胶为基质的凝集素高效亲和色谱材料的制备方法

摘要

本发明涉及亲和材料制备技术领域，是一种以硅胶为基质，合成含有双官能团的间隔臂修饰硅胶，制备出含有高键合量的凝集素亲和材料。其结构特征在于以硅胶为基质，间隔臂末端含有环氧、羟基、羧基、异氰基、醛基等官能团，配基为凝集素。本发明制备凝集素亲和材料的步骤简捷，条件温和、成本低、键合量高、凝集素的性质稳定、且良好的保持了凝集素的活性，可广泛应用于糖蛋白和糖肽的分离和富集。

主权项

一种以硅胶为基质的凝集素高效亲和色谱材料的制备方法，步骤如下：a.硅胶预处理：用酸溶液处理硅胶，活化硅胶表面的羟基；b.含有双官能团间隔臂的制备:在惰气气氛保护下，室温，将氨丙基烷氧基硅烷溶于非质子极性溶剂中，加入双官能团试剂，电磁搅拌4～6小时，得到一端含有烷氧官能团，另一端含有羧基、醛基、异氰基或羟基的硅烷试剂中间体；非质子极性溶剂包括:二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二噁烷、二甲亚砜、乙腈中的一种或二种以上；双官能团试剂为可以和氨基成化学键的试剂，双官能团试剂中的两个官能团可以相同也可以不同，其中双官能团试剂为丁二酸酐、戊二酸酐、苯甲酸酐、戊二醛、双异氰基PEG、单环氧基PEG试剂、醛基PEG、氧化葡聚糖中的一种或二种以上，其中PEG分子量为200～6,000，氧化葡聚糖分子量为1,000～10,000；c.双官能团硅烷化试剂修饰硅胶的制备：在惰气气氛保护下，将步骤a处理好的硅胶溶于有机溶剂中，加入步骤b所得到的产物溶液，加热回流，反应16～48小时；反应体系冷却至室温，减压过滤，依次用甲苯、四氢呋喃、甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在60～100℃下干燥12～24小时，得到间隔臂末端含有可活化官能团的硅胶固定相；氨丙基烷氧基硅烷的使用量与所修饰的硅胶用量的对应关系为0.03～3mmol氨丙基烷氧基硅烷/g硅胶；d.凝集素键合硅胶亲和材料的制备：在惰气气氛保护下，将上述经过合成的烷氧基硅烷化试剂修饰后的硅胶固定相加入无水有机溶剂或者不含有一级氨基的缓冲盐溶液中，加入活化官能团试剂，室温反应2～4小时，减压抽滤，用不含有一级氨基的缓冲盐溶液洗涤并将所得固定相重溶于不含有一级氨基的缓冲盐溶液置于玻璃容器中；活化官能团的试剂为1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3乙基碳二亚胺、EDCI/N‑羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺、羰基二咪唑、二异丙基碳二亚胺、N,N二琥珀酰亚胺碳酸酯中的一种或二种以上；不含有一级氨基的缓冲盐溶液为磷酸盐缓冲溶液、2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液、N‑2‑羟乙基哌嗪‑N′‑2‑乙基磺酸缓冲溶液中的一种；在惰气气氛保护下，将凝集素与和凝集素有特异性结合的糖溶解于不含有一级氨基的缓冲盐溶液中，加入上述的硅胶缓冲盐溶液中，4～25℃搅拌4～24小时，然后加入含有一级氨基的试剂，对未反应完全的活化基团封尾2～4小时，离心，收集固体，得到键合有凝集素的硅胶亲和材料；一级氨基试剂可以为三羟甲基氨基甲烷、氨基乙醇和BSA缓冲溶液中的一种或两种以上；所述凝集素为伴刀豆蛋白凝集素Con A、麦胚凝集素WGA、大豆凝集素SBA、蓖麻凝集素RCA、荆豆凝集素UEA或唾液酸凝集素SNA，与凝集素有特异性结合的糖一一对应的为甲基‑α‑D‑吡喃甘露糖，N‑乙酰葡糖胺，N‑乙酰乳糖胺，乳糖，L‑岩藻糖，N‑乙酰神经氨酸。