[发明专利]一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法

摘要

本发明公开了一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的制备方法，包括利用同源重组方法敲除B. subtilis 168染色体上丙氨酸合成的支路代谢基因L-乳酸脱氢酶基因(ldh)和乙酸激酶基因（ackA），获得突变菌株。单基因突变菌株保藏编号是IBL23-ldh，该突变菌株的构建是通过对枯草杆菌敲除部分乳酸脱氢酶基因实现的；双基因突变菌株是在单基因突变菌株的基础上再次敲除乙酸激酶基因获得，编号为IBL23-ldh/ackA。

主权项

一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）、编号为IBL23‑ldh的单基因突变的枯草杆菌的菌株构建:以B.subtilis IBL23基因组DNA为模板，PCR扩增得到ldh基因，将ldh基因连接到T载体pTG19‑T上，在大肠杆菌IBL15中转化，蓝白筛选得到重组质粒pTG19‑T‑ldh;然后以质粒pKD3为模板，PCR扩增得到氯霉素cm基因，将cm基因用NdeⅠ和 EcoRⅤ双酶切后连接到重组质粒pTG19‑T‑ldh上，在大肠杆菌IBL15中转化，通过氯霉素抗性筛选得到打靶载体pTG19‑T‑ldh∷cm;通过Spizizen法把pTG19‑T‑ldh∷cm在IBL23中转化，成功敲除IBL23染色体上的ldh基因，获得了L‑乳酸脱氢酶缺失突变型菌株IBL23‑ldh;、构建得到双基因突变的枯草杆菌菌株:从L‑乳酸脱氢酶缺失突变型菌株IBL23‑ldh的基因组中PCR扩增得到ackA基因，连接到T载体pTG19‑T上得到重组质粒pTG19‑T‑ackA，然后以质粒pKD4为模板，PCR扩增得到卡那霉素kana基因，将kana基因用EagI和 HpaI双酶切后连接到重组质粒pTG19‑T‑ackA上，在大肠杆菌IBL15中转化，通过卡那霉素抗性筛选得到打靶载体pTG19‑T‑ackA∷kana；通过Spizizen法把pTG19‑T‑ackA∷kana在IBL23‑ldh中转化，成功敲除IBL23‑ldh染色体上的ackA基因，获得了L‑乳酸脱氢酶和乙酸激酶缺失突变型菌株IBL23‑ldh/ackA。