[发明专利]一种从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L-酪氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L-酪氨酸的方法，其特点是将花椒内生耐寒短杆菌于温度30℃恒温培养活化24h后，接种到发酵培养基中，于温度28～37℃，120～180r/min水浴中恒温振荡发酵培养24～72h；将发酵液在常温下以4000～6000r/min的速度离心15min后除去菌体获得上清液冷冻干燥；按样品与Sephadex LH-20质量比1:20～50且上样量为柱体积的20％将发酵液过Sephadex LH-20层析柱，用100mL纯水等度洗脱，按每份收集量20mL等份收集洗脱液F₁～F₅；将组分F₃用制备型液相色谱仪进行分离纯化，冷冻干燥即得到L-酪氨酸，得率为8～15mg/L发酵液。

主权项

一种从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L‑酪氨酸的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)微生物菌种及培养基菌种：由中国典型培养物保藏中心保藏的一株花椒内生耐寒短杆菌属GH‑HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH‑HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)菌株，培养条件为划线接种到斜面培养基上，于温度30℃恒温培养箱中培养24h后，将获得的菌落接种一个单菌落到150mL发酵培养基中，在温度28～37℃下，120～180r/min的水浴恒温振荡器上振荡培养24～72h；其中，耐寒短杆菌斜面培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，初始pH值7.2～7.4；发酵培养基为：1％可溶性淀粉，3.5％黄豆粉，1％NaCl，初始pH值7.0；(2)发酵生产用上述菌种及培养方法将花椒内生耐寒短杆菌属GH‑HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH‑HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)发酵获得发酵液；(3)发酵产物预处理将上述发酵液用低速离心机在常温下以4000～6000r/min的速度离心15min后除去菌体，然后收集上清液，真空冷冻干燥后备用；(4)Sephadex LH‑20柱分离将上述发酵液过Sephadex LH‑20层析柱，按样品与Sephadex LH‑20质量比1:20～50的比例上样，上样量为柱体积的20％；用100mL纯水进行等梯度洗脱，洗脱流速为2～6mL/min；按每份收集量20mL等份收集洗脱液，编号F₁～F₅备用；(5)物质纯化将组分F₃用制备型液相色谱仪(pre‑HPLC)进行分离纯化，条件如下：GL‑science色谱柱(20×250mm,5μm)，流速18.9mL/min，柱温25℃，紫外检测波长280nm，进样量2mL，20％甲醇溶液洗脱30min，收集保留时间为3.8min的色谱峰，冷冻干燥即得L‑酪氨酸，得率为8～15mg/L，其结构式如下：