[发明专利]一种甜樱桃矮化砧木吉塞拉的玻璃化超低温保存方法

摘要

本发明涉及一种低温保存方法，具体涉及一种甜樱桃矮化砧木吉塞拉的玻璃化超低温保存方法，该方法通过将经过低温锻炼后剥取的吉塞拉茎尖，转入装有预培养液的冻存管中进行预培养，后利用装载液进行脱水，去除装载液后注入玻璃化溶液静置一段时间后重新注入玻璃化溶液，放入液氮中进行超低温保存，最后进行化冻恢复培养。本发明采用新型的玻璃化溶液，保存时间长，化冻后采用两次梯度洗脱，茎尖存活率高，经济简便。

主权项

一种甜樱桃矮化砧木吉塞拉的玻璃化超低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：a.低温锻炼将继代生长90天的吉塞拉无菌苗置于4℃的光照培养箱中低温锻炼4周；b.蔗糖预培养将无菌苗在无菌条件下剥取长度为1?1.5mm，含有1?2个叶原基的茎尖，将茎尖迅速转移到装有预培养液的冻存管中，进行预培养1?5d，所述预培养液按每升计含：MS+0.3?0.9mol蔗糖；c.装载及冻存预培养结束后，室温下吸出预培养液，注入装载液，室温静置30min，去除装载液，加入玻璃化溶液，在0℃条件下放置60?90min，然后吸出玻璃化溶液，重新注入新的玻璃化溶液浸没茎尖，然后将冻存管放入液氮中进行超低温保存，所述玻璃化溶液为：50%甘油+50%蔗糖；所述装载液按每升计含：MS+2mol甘油+0.4mol蔗糖；d.化冻及恢复培养将冷冻后的冻存管取出，迅速放入40℃水中化冻1min，加入卸载液采用两步洗涤法进行洗涤，每次7?9min，无菌滤纸吸干茎尖残留的卸载液，将茎尖放入恢复培养基中，暗培养一周，一周后转至温度为25±2℃的光照培养室内进行恢复培养，光照12h/d，所述卸载液按每升计含：MS+0.9mol蔗糖或MS+1.2mol蔗糖；所述恢复培养基按每升计含：MS+0.5mg?6?BA+0.5mol?蔗糖+pH值为5.8，质量浓度为0.7%琼脂；所述的两步洗涤法为首先采用每升含MS+1.2mol蔗糖的卸载液洗涤7?9min，然后再用每升含MS+0.9mol蔗糖的卸载液洗涤7?9min。