[发明专利]一种重组菌株及其全细胞催化生产4-羟基肉桂醛的方法

摘要

本发明公开了一种重组菌株及其全细胞催化生产4-羟基肉桂醛的方法，其特征是利用重组菌株全细胞作为生物催化剂催化4-羟基肉桂酸制备4-羟基肉桂醛，包括以下步骤：（1）构建重组菌株E.coli M15/pQE31-4CL1-CCR；（2）制备重组菌株全细胞；（3）利用上述重组菌株全细胞催化生产4-羟基肉桂醛，得到的产品经高效液相色谱串联质谱法检测。本发明首次提出了用生物转化的方法合成4-羟基肉桂醛的途径，具有反应条件温和，酶活性高，节约成本，操作简便等优点，提供了一种新的合成4-羟基肉桂醛的方法，同时也为植物次生代谢产物的生产提供了一种新思路。

主权项

一种重组菌株及其全细胞催化生产4‑羟基肉桂醛的方法，其特征是在于以重组菌株全细胞为生物催化剂，并在该全细胞体系中添加底物4‑羟基肉桂酸，实现细胞内催化反应制备4‑羟基肉桂醛；所用的底物4‑羟基肉桂酸选用香豆酸、咖啡酸和阿魏酸，浓度为1mM；重组菌的构建提取基因组的毛白杨为741毛白杨；为了获得4CL1‑CCR的完整序列，我们以4‑香豆酸：辅酶A连接酶（4CL1）和肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）的全长cDNA质粒载体作为PCR扩增反应模板；利用引物2和引物3的重叠区域进行多重PCR实验，以及含有SphⅠ限制性酶切位点（下划线）的引物1和含有KpnⅠ限制性酶切位点（下划线）的引物4进行PCR反应扩增双功能酶基因片段：引物1：5’‑ggcatgcatgaatccacaagaagaattc‑3’，引物2：5’‑gatgaagcatcaaccggcatagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccagaaccaccaccacctatgcctgccaacttttctttcag‑3’，引物3：5’‑atgccggttgatgcttcatcactttcag‑3’，引物4：5’‑gggtaccttattgaatcttcacagactcttc‑3’，循环利用PCR产物与PMD18‑T载体相连，获得重组PMD18‑T4CL1‑CCR；PCR扩增的保真度通过DNA测序分析；扩增产物利用SphⅠ和KpnⅠ进行酶切，然后插入空载体pQE31的同一位点上，构建重组质粒pQE31‑4CL1‑CCR，转入大肠杆菌构建重组菌株E.coliM15/pQE31‑4CL1‑CCR；该重组菌株具有催化4‑羟基肉桂酸还原为4‑羟基肉桂醛的能力；所述双功能酶的核苷酸序列为序列表中所示；重组菌株全细胞的制备LB固体培养基，以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，pH7.5，氨苄青霉素0.1，卡那霉素0.025；LB液体培养基，以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，琼脂粉15，pH7.5，氨苄青霉素0.1，卡那霉素0.025；将含有双功能酶基因的重组菌株pQE31‑4CL1‑CCR的大肠杆菌M15接种于LB固体培养基，活化；挑取重组菌株单菌落接种于5mL含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养至控制OD600为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.4mmol/L,于28°C、200rpm诱导培养8h；重组菌株全细胞催化生产4‑羟基肉桂醛由50mL反应体系组成：50mL含重组菌株全细胞的LB液体培养基，终浓度为1mM的底物4‑羟基肉桂酸；反应混合物于37°C、200rpm避光振荡反应2‑32h,反应后混合物用等体积乙酸乙酯萃取，有机相用于产物分析；产物通过高效液相色谱串联质谱法进行分析；反相高效液相色谱柱为ZORBAX 300SB‑C18柱（2.1× 150 mm， 3.5 μm; Agilent，Santa Clara， CA，USA），流动相为乙腈，流速0. 10~0.15 mL/min，检测波长为325 nm；质谱为配备ESI源的离子阱质谱（LCQ DECA XP MAX）。