[发明专利]一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法

摘要

本发明公开了一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法，包括烟草子叶苗的准备、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备、灌根接种、染色观察等几个步骤。该方法只需要在人工气候箱或培养室内使用培养皿海绵加滤纸保湿即可接种疫霉，显微镜下直接观察染色、脱色后的子叶苗胚根，具有操作简便、快捷的特点，适用于烟草疫霉侵染烟草的过程观察、不同品种抗性检测。

主权项

一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法，其特征在于包括烟草子叶苗的准备、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备、灌根接种、染色观察步骤，具体包括：A、烟草子叶苗的准备：将烟草种子表面消毒后播种于发芽床上，于相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下培养7~10天后发芽形成子叶苗备用；B、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28℃下黑暗培养7~10天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，液体培养诱导产生游动孢子囊、低温促进游动孢子囊释放游动孢子疫霉，用无菌水调节游动孢子浓度为10^4~6个/ml得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；C、灌根接种；取B步骤获得的烟草疫霉游动孢子悬浮液缓慢滴加至发芽床，让其渗透到每株子叶苗的根部；D、染色观察：接种后的子叶苗在相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下继续培养，每隔4小时取子叶苗，去除子叶及子叶相连胚根的2/3，得胚根样品，浸没到台盼蓝或苯胺蓝工作液中，沸水水浴1min，室温至少12小时过夜，取出染色子叶苗胚根放入水合三氯乙醛溶液中脱色至少30分钟，纯水冲洗样品1~3次，显微观察样品细胞死亡、孢子萌发和菌丝生长情况。