[发明专利]纳米磁珠法筛选呼吸道合胞病毒记忆性B细胞的方法

摘要

纳米磁珠法筛选呼吸道合胞病毒记忆性B细胞的方法，是采用特异性抗原与抗体相结合的理论，通过呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD耦联纳米磁珠，然后将分离得到的人外周血单核细胞加入到已经制备好的含纳米磁珠管中，由于人外周血单核细胞中的针对呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞表面有IgM和IgD,耦联在纳米磁珠的呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD能特异地结合IgM和IgD，从而将针对呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞从人外周血单核细胞中分离出来。本发明的优点是：纳米磁珠筛选呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞的方法操作简单，分离快速、高效，灵敏度高，适用于针对任何病毒的记忆性B细胞的快速分离，此外，也可全面监测RSV感染者。

主权项

纳米磁珠法筛选呼吸道合胞病毒记忆性B细胞的方法，其特征是：A、连接纳米磁珠和GD和GL抗原蛋白：将呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD各20ul分别加入至含有10ul结合缓冲液的纳米磁珠中，室温，垂直混合过夜；用磁铁吸附纳米磁珠，去掉上清， 加入100ul清洗缓冲液II，用移液枪吹打均匀，磁珠吸附纳米磁珠，去掉上清清洗2次；加入90ul结合缓冲液，10ul封闭液，垂直混合，室温反应60分钟；用磁铁吸附纳米磁珠，去掉上清，加入100ul清洗缓冲液II，清洗1次；加入30ul结合缓冲液，用移液枪吹打混匀，待用；B、人外周血单核细胞的分离：将采集的新鲜抗凝血与生理盐水1:1稀释后，缓慢加入到等体积的淋巴细胞分离液中离心，离心速度2000rpm, 离心20min，将其拿出，并吸取第二层乳白色云雾状的人外周血单核细胞层于装有生理盐水的15mL离心管中洗涤，离心速度1500rpm, 离心5min,弃上清，再用生理盐水洗涤1次，将收集到的细胞用10% FBS的1640培养基重悬于细胞培养瓶中；C、 纳米磁珠法筛选呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞：加入100ul人外周血单个核细胞，加入前面制备好的30ul纳米磁珠，室温下离心，离心速度180rpm，混合1h；用磁铁吸附纳米磁珠，去掉上清，加入100ul清洗缓冲液II，用移液枪吹打混匀；重复上述步骤3次，以充分洗掉非特异性结合的细胞，向细胞‑抗体‑纳米磁珠复合物中加入30ul结合缓冲液，用移液枪吹打混匀，移至96孔板中镜下观察，显微镜下观察到的与纳米磁珠耦连的细胞即为纳米磁珠筛选到的呼吸道合胞病毒的记忆性B细胞。