[发明专利]一种剑叶龙血树愈伤组织诱导及防褐化的方法

摘要

一种剑叶龙血树愈伤组织诱导及防褐化的方法，包括如下步骤：(1)取剑叶龙血树种子作为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导出芽；(3)将无菌芽置于MS诱导培养基中进行培养获得愈伤组织；(4)将愈伤组织置于MS增殖培养基中进行培养得到大量的愈伤组织。(5)将大量的愈伤组织置于MS防褐化培养基中进行培养得到质地疏松的愈伤组织。采用本发明所述方法得到的愈伤组织翠绿色或者乳黄色、生长快、不易褐化，可诱导增殖出大量生长良好且褐化率低的愈伤组织，为医学提取“血竭”提供优质材料，进一步满足市场需求。

主权项

一种剑叶龙血树的愈伤组织诱导及防褐化的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)外植体的消毒：取剑叶龙血树种子作为外植体，先用洗洁精水溶液清洗种子表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗5～8min，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30S，无菌水冲洗1遍，再用添加了1‑2滴吐温‑20的100ml浓度为0.1％HgC1₂消毒8～15min，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；(2)种子诱导：将步骤(1)得到的外植体接种到MS诱导培养基中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/(m²·s)，光照时间为12h/d的条件下培养15d，种子发芽，所述种子诱导MS诱导培养基为MS基本培养基中加入0.5mg/L的6‑苄基腺嘌呤6‑BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；(3)芽诱导获得愈伤组织：将步骤(2)中得到的无菌芽置于MS诱导培养基中，在培养温度25±2℃，光照强度20～30μmol/(m²·s)，光照时间为10h/d的条件下培养7d开始萌发，15d便形成愈伤组织，所述芽诱导MS诱导培养基为MS基本培养基中加入0.1～2.0mg/L的6‑苄基腺嘌呤6‑BA、0.05～0.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.1～1.0mg/L的萘乙酸NAA、0.1～1.0mg/L的2,4‑二氯苯氧乙酸2,4‑D，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；(4)愈伤组织增殖培养：将步骤(3)中得到的愈伤组织置于MS增殖培养基中，培养温度25±2℃，光照强度20～30μmol/(m²·s)，MS增殖培养基为MS基本培养基中加入0.1～1.0mg/L的6‑苄基腺嘌呤6‑BA、0.5～2.0mg/L的萘乙酸NAA、0.1～0.5mg/L的激动素KT,30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；(5)防褐化培养：将步骤(4)中得到的愈伤组织置于MS防褐化培养基中，在培养温度25±2℃，光照强度20～30μmol/(m²·s)，光照时间为10h/d的条件下培养分别培养40d，MS防褐化培养基为MS基本培养基中加入防褐添加剂20～100mg/L的VC，0.5～2.0g/L的活性炭，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。