[发明专利]一种猪带绦虫TSOL18基因重组卡介苗制备及鉴定方法

摘要

本发明公开了一种猪带绦虫TSOL18基因重组卡介苗制备及鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）质粒pMV261的扩增与鉴定；（2）重组质粒pMV261-TSOL18的构建及鉴定；（3）猪带绦虫TSOL18基因重组卡介苗的构建及鉴定：①BCG感受态细菌的制备；②重组质粒pMV261-TSOL18电转化BCG感受态细菌；③猪带绦虫TSOL18基因重组卡介苗的鉴定：挑取上述阳性菌落中单个菌落至含Kana的M7H9ADC液体培养基中，振荡培养；取菌液，离心；弃上清，ddH₂O洗涤，离心弃上清；加入ddH₂O，重悬后沸水浴；冰浴，离心，吸取上清作为PCR模板，进行PCR鉴定。

主权项

一种猪带绦虫TSOL18基因重组卡介苗制备及鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）质粒pMV261的扩增与鉴定：先制备E.coli DH5α感受态细胞，使用pMV261质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，进一步扩增与鉴定，将鉴定正确的pMV261质粒进一步培养，留种并提取质粒备用；（2）重组质粒pMV261‑TSOL18的构建及鉴定：将载体pGEX‑1λT‑TSOL18与质粒pMV261分别用 BamHⅠ和 EcoRⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，割取含所要回收DNA 的琼脂块，放入到离心管中，回收并纯化 PCR 产物；然后将胶回收的相应片段连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，抽提质粒，进行酶切、PCR和测序鉴定；（3）猪带绦虫TSOL18基因重组卡介苗的构建及鉴定①BCG感受态细菌的制备1）取BCG菌液，接种于含有ADC的M7H9‑Tween80液体培养基中，振荡培养；2）待OD600达到0.5~1.0（对数生长期）时，冰浴，离心；3）加入甘油，重悬，离心；4）弃上清，重复步骤3）；5）加入甘油，重悬混匀，待用；②重组质粒pMV261‑TSOL18电转化BCG感受态细菌1）在步骤①中制备的BCG感受态中加入步骤（2）中制备的重组质粒，混匀，冰浴静置，转移至电转杯中，进行电击；2）转化后加入M7H9ADC液体培养基，混匀后振荡培养；3）取上述混合液涂布于含有Kana的M7H9ADC固体培养基，培养，筛选阳性菌落；③猪带绦虫TSOL18基因重组卡介苗的鉴定：挑取上述阳性菌落中单个菌落至含Kana的M7H9ADC液体培养基中，振荡培养；取菌液，离心；弃上清，ddH₂O洗涤，离心弃上清；加入ddH₂O，重悬后沸水浴；冰浴，离心，吸取上清作为PCR模板，进行PCR鉴定。