[发明专利]一种用于调控的DNA链置换反应的缝合Toehold活化方法和工具包

摘要

本发明提供了一种用于调控的DNA链置换反应的缝合Toehold活化方法和工具包。基于DNA发夹结构与不同环境刺激物(Hg2+或ATP)之间的相互作用引发的发夹重构，我们发展了一种新的Toehold活化方法。通过改变环境刺激物的浓度，可实现对DNA链置换反应额外水平的精确调控。

主权项

一种用于调控的DNA链置换反应的缝合Toehold活化方法，其特征在于，包括：1)结合诱导的缝合Toehold链置换反应的探针制备制备Hg2+诱导的缝合Toehold介导链置换反应中的RS：加入10μL，10μM FAM标记的TB和10μL，50μM BHQ1标记的B*到80μL的T‑Mg buffer pH8.0中，终浓度为1μM；将该溶液放置90℃恒温反应器中孵育5min，然后使其慢慢降至室温，放置2h待用；将终浓度为5μM的非活化状态Hg2+结合序列BS加入到T‑Mg buffer pH8.0中退火，同样是放置90℃恒温反应器中孵育5min，然后使其慢慢降至室温，放置2h；2)缝合Toehold介导链置换反应在100μL T‑Mg buffer中，加入500nM BS,100nM RS和不同浓度的Hg2+，室温下反应3h，引发了Hg2+诱导的BS构象转变和缝合Toehold介导链置换反应过程，即得；其中，BS由Hg2+结合序列(H)22、toehold部分(T)、链迁移部分(B)和一段辅助序列组成；辅助序列的作用是将一部分B序列封闭在发夹的分子内结构中，避免Hg2+不存在时DNA链置换反应的发生；RS是由标记荧光染料FAM的TB和标记淬灭基团的B*杂交形成，其最初的荧光是被淬灭的；当有Hg2+存在时，多个T‑Hg2+‑T金属碱基对的形成促使发夹结构发生构象转变，进而使toehold部分和链迁移部分靠近，有效地引发DNA链置换反应；同时，标记淬灭基团的B*链得以释放，使荧光得到恢复；活化状态下BS的茎部序列组成是(GC)5(TT)8,(GC)6(TT)8,和(GC)6(TT)10。