[发明专利]一种促进间充质干细胞向神经前体细胞定向分化、增殖的方法

摘要

本发明提供了一种促进间充质干细胞向神经前体细胞定向分化、增殖的方法。首先将间充质干细胞包埋在氯化钙溶液条件下制备的、含有明胶微球和硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠中，之后添加神经诱导分化培养液，并在旋转式反应器中进行培养，以促进间充质干细胞向神经前体细胞体外定向分化，并实现其增殖，分化结束后，利用柠檬酸钠溶液溶解海藻酸钙微胶珠，收获分化细胞。本发明操作简单，成本低，明胶微球可为支架内部细胞提供必要的生长空间，硫酸软骨素可模拟神经组织细胞外基质的生化功能，而海藻酸钙微胶珠提供了近似细胞外基质的三维结构支撑，旋转式反应器则提供了必要的微重力环境，进一步强化传质，并实现其增殖。

主权项

1.一种促进间充质干细胞向神经前体细胞定向分化、增殖的方法，其特征在于：首先将10% W/V酸性明胶溶液滴加到无菌油酸乙酯或大豆油中，经过1000rmp搅拌10min，冰水浴冷却10min，并PBS清洗去除油相后得到直径为100‑200μm的明胶微球；之后将明胶微球及间充质干细胞与海藻酸钠、硫酸软骨素及生理盐水的混合溶液，其中海藻酸钠和硫酸软骨素的质量比为2.3‑6：1，海藻酸钠/硫酸软骨素/生理盐水混合溶液和明胶微球的体积比为5‑15：1，混合均匀，并滴加到氯化钙溶液中进行钙化反应以得到含有干细胞、明胶微球和硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠，之后再添加神经诱导分化培养液，并在旋转式反应器中进行培养，以促进间充质干细胞向神经前体细胞体外定向分化，并实现其增殖，在分化结束后，利用柠檬酸钠溶液溶解海藻酸钙微胶珠，收获分化细胞;所述间充质干细胞包括骨髓、脐带、胎盘、脂肪组织来源的间充质干细胞中的一种;所述间充质干细胞在海藻酸钠溶液与硫酸软骨素溶液以及生理盐水混合液中的起始包埋密度为4×10⁶‑1×10⁷cells/mL;所述硫酸软骨素的分子量为30‑40kDa，硫酸软骨素溶液浓度为10%W/V；所述海藻酸钠的分子量为400‑800kDa，所述海藻酸钠为精氨酰‑甘氨酰‑天冬氨酸RGD修饰海藻酸钠，异亮氨酸‑赖氨酸‑缬氨酸‑丙氨酸‑缬氨酸IKVAV修饰海藻酸钠和酪氨酸‑异亮氨酸‑甘氨酸‑丝氨酸‑精氨酸YIGSR修饰海藻酸钠质量比为1:1:1的混合海藻酸钠；所述氯化钙溶液的浓度为200‑300mM。