[发明专利]利用CRISPR-Cas9系统敲除动物FGF5基因的方法有效
| 申请号： | 201410751079.1 | 申请日： | 2014-12-09 |
| 公开（公告）号： | CN104531704B | 公开（公告）日： | 2019-05-21 |
| 发明（设计）人： | 侯健;厉建伟;安晓荣 | 申请（专利权）人： | 中国农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/89;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君 |
| 地址： | 100193 *** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | 本发明提供了一种利用CRISPR‑Cas9系统敲除动物FGF5基因的方法。本发明首先获得针对FGF5第二外显子的sgRNA识别区的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；接着构建FGF5第二外显子的sgRNA表达结构，并将T7启动子插入sgRNA转录起始位点前，同时构建Cas9蛋白的体外转录载体，以T7启动子调控。利用Cas9和sgRNA的体外转录载体获得Cas9 mRNA和sgRNA，可用于生产敲除FGF5基因的动物。 | ||
| 搜索关键词： | 利用 crispr cas9 系统 动物 fgf5 基因 方法 | ||
【主权项】：
1.利用CRISPR‑Cas9表达系统敲除动物FGF5基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建特异性靶向FGF5基因第二外显子的sgRNA的表达载体；通过体外转录表达得到FGF5基因第二外显子sgRNA，所述sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；(2)构建Cas9蛋白的体外转录载体，得到Cas9mRNA；所述Cas9蛋白的体外转录载体的构建方法为：1)以内切酶AgeI和NotI酶切pX330‑U6‑Chimeric_BB‑CBh‑hSpCas9获得pX330载体中的Cas9表达区段；2)以AgeI和NotI线性化载体pIRES‑puro3；3)将两端序列连接获得终载体pCas9‑puro3(3)将步骤(1)的sgRNA和步骤(2)的Cas9mRNA纯化后，混合，注射入动物受精卵细胞质或细胞核中，然后经体外短时培养后移植入同种雌性动物输卵管中，或体外培养至囊胚期移植到同种雌性动物子宫中，以生产敲除FGF5基因的动物；所述动物为小鼠，猪，牛，绵羊，山羊。
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