[发明专利]一种舒洛地特组分精细结构分析检测方法

摘要

本发明公布了一种舒洛地特组分精细结构检测方法，包括：(1)肝素组分结构解析：硫酸软骨素ABC酶酶解硫酸皮肤素后进行肝素组分完整糖链分析，再经肝素酶I部分酶解后进行肝素糖链分析，或经肝素酶I、II、III全酶解后进行肝素二糖分析；(2)肝素组分特征基团结构解析：肝素酶I酶解肝素后经P10柱进行寡糖分离收集，然后用凝胶G25脱盐柱脱盐后用质谱进行肝素特征基团结构解析；(3)硫酸皮肤素组分结构解析：用亚硝酸钠降解肝素组分后，再用硫酸软骨素ABC酶酶解硫酸皮肤素，进行硫酸皮肤素二糖分析。本发明分析准确、重现性好，可改进现有理化检测分析手段的不足。

主权项

1.一种进行舒洛地特组分精细结构确定的分析方法，包含对硫酸皮肤素及肝素组分的酶解、分离，最后采用高效液相色谱或液质联用检测方法进行肝素组分及硫酸皮肤素组分结构分析，其特征在于：肝素组分结构分析：(1)用硫酸软骨素ABC酶对硫酸皮肤素组分进行特异性酶解得到肝素组分，酶解步骤，100μl样品+100μl软骨素ABC酶+800μl Tris，酶解温度37℃，酶解时间为4h，分析检测条件：色谱柱为TSK 3000 SWxl 7.8mm*30cm，流动相为含0.02％叠氮钠溶液的0.77％乙酸铵溶液，流速为0.4ml/min，柱温为30℃，进样体积为20μl，检测器为示差折光检测器，检测依据为以酶解标样的保留时间为定性依据来检测待测样品的酶解产物；(2)用肝素酶I进行部分酶解，得到肝素寡糖及部分二糖，酶解步骤，20μl样品+pH为7.0的乙酸钙溶液70μl+pH 7.0磷酸二氢钠溶液溶解的肝素酶I溶液100μl，酶解温度为25℃，酶解时间为24h，检测条件：色谱柱为Waters Spherisorb S5SAX 4.0*250mm，流动相A为0.04％的NaH2PO4溶液，流动相B为0.04％的NaH2PO4‑14％的NaClO4溶液，流速为0.45ml/min，柱温为35℃，进样体积为10μl，检测器为紫外检测器，检测波长为234nm，采用如下梯度洗脱方式，0～20min，97～65％A；20～50min，65～0％A；50～60min，0％A；60～60.1min，0～97％A；60.1～80min，97％A；(3)用肝素酶I、II、III进行完全酶解得到二糖后进行肝素组分结构分析，酶解温度为25℃，酶解时间为48h，分析检测条件同1‑(2)检测条件；肝素组分特征基团结构解析：(1)用肝素酶I轻度酶解肝素组分，酶解条件同1‑(2)酶解条件；(2)用Bio‑Gel P10自装凝胶柱进行寡糖分离并依次收集各组分，采用色谱柱：Bio‑Gel P10自装凝胶柱，流动相：1.0mol.L‑1氯化钠溶液，流速：0.4ml/min，进样体积：1ml，检测器：紫外检测器，检测波长：232nm；(3)用交联葡聚糖凝胶G25自装脱盐柱分别脱盐，脱盐条件如下，色谱柱：交联葡聚糖凝胶G25自装脱盐柱，流动相：超纯水，流速：0.9ml/min，进样体积：1ml，检测器：紫外检测器，检测波长：215nm；(4)用质谱对肝素各组分精细结构进行解析，质谱解析条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB‑C18 5μm，0.5×250mm，毛细柱，流动相A：pH为7.0的15mmol.L‑1三丁胺水溶液，流动相B：15mmol.L‑1三丁胺，pH为7.0的75％乙腈溶液，流速：10μl/min，洗脱梯度：0～5min，20％B，5～65min，20～60％B，质谱条件为：喷雾电压：+3.6kV，喷雾气流速：0.5L/min，扫描质量范围：900～3000；硫酸皮肤素组分解析：(1)用亚硝酸钠降解肝素，具体做法为取浓度为10mg/ml的样品溶液500μl，加1mol.L‑1盐酸溶液250μl混合，加入250mg/ml的亚硝酸钠溶液50μl，轻轻混匀，并在室温放置40min，加入1mol.L‑1氢氧化钠溶液200μl终止反应，得到硫酸皮肤素组分；(2)用硫酸软骨素ABC酶酶解硫酸皮肤素，进行其二糖结构分析，二糖高效液相色谱检测条件：色谱柱：Waters Spherisorb S5SAX 4.0*250mm，流动相A：采用盐酸调pH至3.5的超纯水，流动相B：采用盐酸调pH至3.5的1mmol.L‑1氯化钠，流速：1.0ml/min，柱温：35℃，进样体积：20μl，检测器：紫外检测器，检测波长：240nm，采用如下梯度洗脱方式，0～4min，100％A；4～45min，100～50％A；45～45.1min，50～100％A；45.1～55min，100％A。