[发明专利]一种海洋微藻叶黄素的提取工艺

摘要

本发明公开一种海洋微藻叶黄素的提取工艺，通过基因工程技术对高产叶黄素海洋微藻进行分子生物学改造得到优质叶黄素生产藻种，采用柱层析色谱分离纯化微藻中的叶黄素，并利用重结晶技术对叶黄素产品进行精制。本发明的有益效果是劳动成本低，不受时间、空间的限制，产量高，质量好，安全环保，产生良好的经济与社会效益。

主权项

一种海洋微藻叶黄素的提取工艺，其特征在于：包括以下步骤：(1)采用叶绿素荧光成像系统，快速高通量筛选叶绿素荧光强的微藻，将初步筛选的待定微藻进行扩大培养，利用高效液相色谱(HPLC)准确分析藻细胞中叶黄素含量，最终筛选到叶黄素含量高的优质微藻。(2)对筛选的优质高产叶黄素微藻进行基因组测序，并利用生物信息学软件进行基因功能注释与进化分析。(3)培养海洋微藻至对数生长期中期，利用RNA‑seq测序技术进行基因转录水平分析，并根据各个基因表达水平的高低，初步筛选叶黄素合成途径中的限制性关键酶，初步构建该藻细胞内叶黄素的合成途径。(4)构建高产叶黄素基因工程藻株，提高叶黄素合成途径关键酶的活力，从而提高叶黄素的合成量。(5)提取海洋微藻细胞总RNA，利用逆转录PCR扩增DXS1，GGPPS,PSY,LCYE等酶的cRNA，将PCR产物连接到载体pMD18‑T，进行测序验证。(6)构建表达载体并进行表达载体转化，得到高产叶黄素基因工程藻。(7)将基因工程藻进行发酵培养，使得小球藻叶黄素的合成量达到8‑10mg/Ml，在水平管式光合反应器中进行扩大培养，确定培养液流动的速度，光照强度，CO₂通入量等参数。(8)采用复合酶进行酶法破壁，再利用低渗缓冲溶液，使细胞内容物膨胀，然后用超声波进行辅助破碎，提高破壁效果。(9)使用乙醇作为携带剂，利用均匀设计优化萃取条件，利用HPLC以及HPLC‑MS检测与鉴定提取物中叶黄素的含量，并计算提取率。(10)采用柱层析色谱对叶黄素进行分离纯化，用丙酮提取破壁后的小球藻细胞中的总色素，然后采用聚苯乙烯‑二乙烯苯型反相树脂进行反相层析分离叶黄素与叶绿素及其它类胡萝卜素，确定正己烷‑甲醇‑水洗脱体系的溶剂配比，并进行梯度洗脱，收集叶黄素组分，最后利用重结晶技术进行精制，得到叶黄素纯品，检测含量并计算提取率。