[发明专利]沉默神经系统CNN3基因表达的shRNA分子及其应用

摘要

本发明提供了一种沉默神经系统CNN3基因表达的shRNA分子，沉默神经系统CNN3基因表达的shRNA分子，包括正义链和反义链，所述正义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.4所示，所述反义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.5所示，构建了含有此shRNA分子的慢病毒载体，为研究癫痫发病机制与治疗的潜在关系打下基础，有利于在癫痫病治疗中的应用。经在动物大脑微量注射入携带本发明所述干扰序列2shRNA分子的慢病毒载体，其表达蛋白calponin‑3表达量下降80.65%。 1

主权项

1.一种沉默神经系统CNN3基因表达的shRNA分子在制备治疗癫痫药物中的应用，其特征在于，所述shRNA分子的正义链为5'‑gatccGGAGAACATCGGCAACTTTATAGAGAACTTATAAAGTTGCCGATGTTCTCCTTTTTTg‑3'；

所述shRNA分子的反义链为

5'‑aattcAAAAAAGGAGAACATCGGCAACTTTATAAGTTCTCTATAAAGTTGCCGATGTTCTCCg‑3'；

所述shRNA分子的干扰靶点序列为

GGAGAACATCGGCAACTTTAT。

2.一种如权利要求1中所述的 shRNA 分子构建shRNA分子的慢病毒载体的方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）shRNA 靶点设计：根据GenBank 数据库中大鼠CNN3 的基因序列以及shRNA的干扰序列设计原则，设计多个RNA干扰靶点序列，选择1 条最佳动力学参数的干扰靶点序列进入后续实验流程，其中，干扰靶点序列如下：

GGAGAACATCGGCAACTTTAT；

（2）shRNA 分子的设计：根据选择的干扰靶点序列设计shRNA分子，

所述shRNA分子的正义链为：

5'‑gatccGGAGAACATCGGCAACTTTATAGAGAACTTATAAAGTTGCCGATGTTCTCCTTTTTTg‑3'；

所述shRNA分子的反义链为

5'‑aattcAAAAAAGGAGAACATCGGCAACTTTATAAGTTCTCTATAAAGTTGCCGATGTTCTCCg‑3'；

（3）慢病毒载体构建：将上述设计的shRNA分子的正义链和反义链常规退火后合成双链，得到退火片段；准备双酶切pGMLV‑SC5RNAi慢病毒载体质粒，将退火片段分别与酶切后的pGMLV‑SC5RNAi 慢病毒载体质粒连接；将连接产物转入大肠杆菌；挑取单菌落进行PCR及测序鉴定，得到阳性的克隆质粒。