[发明专利]一种纯化尿促卵泡素的工艺

摘要

本发明公开了一种纯化尿促卵泡素的工艺。本发明的技术方案是利用协和树脂、DEAE-Cellulose柱层析、CM-Sepharose柱层析、Aptamer-Sepharose柱层析等工序将尿促卵泡素粗品进行纯化的一种工艺，本发明具有工艺技术简化,产品收率高,生产成本低等优点。

主权项

一种纯化尿促卵泡素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）粗品提取：在8‑12℃条件下，将粗制品干粉投入乙酸铵粗提取液，搅拌，离心，取上清液，离心渣投入乙酸铵粗提取液，搅拌，离心取上清液，合并两次上清液，按1：2(V/V)倍比例加95%乙醇，搅拌，沉淀；去上清液，沉淀物用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，沉淀物真空干燥得粗提品；（2）协和工序：在8‑12℃条件下，将粗提品溶于1醋酸钠缓冲液，搅拌溶解，离心取上清液；沉淀物用醋酸钠缓冲液溶解，离心，取上清液，合并上清液，加入协和树脂，搅拌2小时，离心弃去上清液；沉淀物用醋酸钠缓冲液洗涤至280nmOD值小于0.25为止；加入乙酸铵洗脱液，搅拌洗脱，离心得上清液；加入乙酸铵洗脱液，搅拌洗脱，离心得上清液，弃去树脂；合并两次上清液，加入6倍量（V/V）的95%乙醇，搅拌30分钟，静置12‑16小时；去上清液，沉淀物用无水乙醇脱水两次，离心去上清液，沉淀物置真空干燥箱中真空内干燥得协和品；（3）DEAE‑Cellulose柱层析工序： 在8‑10℃条件下，将协和品溶Tris‑HCl缓冲液（SB）中，搅拌溶解；上样，上样结束后，用SB洗涤至峰回落到接近基线；用含0.5mol/L NaCl的Tris‑HCl缓冲液洗脱至峰回落到接近基线；用含1 mol/L NaCl的Tris‑HCl缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰；向收集液加入95%乙醇，搅拌沉淀 12‑16小时；弃去上清液，离心，弃上清液；用无水乙醇洗涤，研磨，离心弃去上清液，重复二次；将沉淀物置真空干燥箱内干燥，干燥后得DE层析品；（4）CM‑Sepharose柱层析工序：在8‑10℃条件下，将DE层析品溶于醋酸钠缓冲液中，搅拌溶解；上样，上样结束后，用醋酸钠缓冲液洗涤至峰回落到接近基线；用含0.1mol/L NaCl的磷酸钠缓冲液洗脱至峰回落到接近基线；用含0.5mol/L NaCl的磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰；向收集液加入乙醇，沉淀12‑16小时；弃上清液，离心弃上清液；用无水乙醇洗涤，研磨，离心弃去上清液，重复二次；将沉淀物置干燥箱内干燥，干燥后得CM层析品；（5）Aptamer‑Sepharose柱层析工序：在8‑10℃条件下，将CM层析品溶于磷酸钠缓冲液（SB）中，搅拌使其溶解；上样，上样结束后，用SB洗涤至峰回落到接近基线；用含0.1mol/L NaCl柠檬酸钠缓冲液（PH5.0）洗脱至峰回落到接近基线；用含0.5mol/L NaCl柠檬酸钠缓冲液（PH5.0）洗脱，收集洗脱活性峰；向收集液加入95%乙醇，沉淀 12‑16小时；弃去上清液，离心弃去上清液；用无水乙醇洗涤，研磨，离心弃上清液，重复二次；将沉淀物干燥，干燥后得AS层析品；（6）去热原：将AS层析品溶解于纯化水中，加入乙醇和乙酸铵，加入0.2mol/L磷酸钠溶液，搅拌，加入0.3mol/L醋酸钙，用5mol/L氢氧化钠溶液调节PH至8.3‑8.7，离心，弃沉淀物，上清液用5mol/L 盐酸溶液调pH至6.5‑7.0，加入5倍量95%乙醇，沉淀析出，离心干燥，得成品。