[发明专利]一种抗蛇毒血清的制取工艺

摘要

本发明公开了一种抗蛇毒血清的制取工艺，其工艺步骤为：(1)动物的选择与免疫；(2)制备免疫细胞；(3)基因重组：运用DNA重组技术，将荧光蛋白基因重组到免疫细胞分泌抗体的基因序列中，得到重组细胞，纯化培养，取20-8重组细胞悬液备用；(4)制备骨髓细胞；(5)细胞融合；(6)选择培养；(7)后期培养，本发明的抗蛇毒血清中具有明显的标记基因——荧光蛋白基因，医学用于诊断时，过程中有荧光出现，则反应为阳性，便于诊断的进行，本发明的细胞生长繁殖快，制取周期短，杂交融合率高，适于推广应用。

主权项

一种抗蛇毒血清的制取工艺，其特征在于，其工艺步骤如下：(1)动物的选择与免疫：选用BALA/C纯种小白鼠，初次免疫蛇毒2～50μg加佐剂脾内注射0.8～2ml；3周后，第二次免疫剂量同上，加佐剂腹腔内注射，其剂量不宜超过0.5ml；3周后，第三次免疫剂量同一，不加佐剂腹腔内注射，5～7天后采血测其效价；2～3周，加强免疫，蛇毒量50～500μg为宜，静脉内注射；3天后，取细胞融合；(2)制备免疫细胞：最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，培养液洗一次，脾脏研碎，过细胞筛，离心，细胞用培养液洗3次，制得脾淋巴细胞悬液，备用；(3)基因重组：运用DNA重组技术，将荧光蛋白基因重组到免疫细胞分泌抗蛇毒血清的基因序列中，得到重组细胞，纯化培养，取20‑8重组细胞悬液备用；(4)制备骨髓细胞：从BALA/C纯种小白鼠体内提取骨髓细胞，体外培养，取对数生长骨髓细胞离心，用无血清培养液洗3次，计数，取得20‑7细胞备用；(5)细胞融合：将骨髓细胞与重组细胞按2：20的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗2次，离心之后弃上清液，使细胞沉淀略松动，90s内加入37℃预温的2ml 45％乙二醇溶液，边加边轻微摇动，37℃水浴作用90s，而后加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，离心之后弃上清液，得到杂交细胞；(6)选择培养：将制取的杂交细胞用含20％小牛血清HAT选择培养液培养，杂交细胞布满孔底2/20面积时，开始检测抗蛇毒血清，筛选出所需要的目标细胞；(7)后期培养：将上述目标细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加200μl，将培养板置37℃、5％CO2培养箱中培养。