[发明专利](‑)γ‑内酰胺的制备方法

摘要

本发明揭示了一种(‑)γ‑内酰胺的制备方法，先通过硫磺矿硫化叶菌(+)γ‑内酰胺酶基因的大肠杆菌工程菌进行发酵，制得相关酶液，然后通过共价结合法固定化γ‑内酰胺酶，最后拆分γ‑内酰胺酶制得(‑)γ‑内酰胺。本发明中对硫磺矿硫化叶菌(+)γ‑内酰胺酶是一种耐高温且温度稳定性好的酶，80℃处理15min对酶的影响较小，而大肠杆菌的绝大多数蛋白都会变性沉淀，使得纯化方法变得简单有效。

主权项

(‑)γ‑内酰胺的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、共价结合法固定化γ‑内酰胺酶；S2、拆分γ‑内酰胺酶制得(‑)γ‑内酰胺；其中，所述S1包括，S11、预处理步骤：a、洗涤，用2‑5倍质量体积比的0.2mol/L、pH＝7.0‑9.0的磷酸缓冲液对伯氨基树脂用磷酸盐缓冲液洗涤2‑3次，过滤得到洗涤平衡的伯氨基树脂，所述伯氨基树脂的平衡pH值为6.5‑8.5；b、预活化，在洗涤后的伯氨基树脂中加入戊二醛溶液进行树脂的预活化，使混合物的终浓度为1％‑6％，在室温下连续搅拌4‑8h，过滤得到固定前树脂；反应式如下：S12、制备酶液：c、菌体制备，将含有硫磺矿硫化叶菌(+)γ‑内酰胺酶基因的大肠杆菌工程菌进行发酵，罐上发酵条件为：温度37℃，通气量1vvm，转速偶联溶氧，使溶氧范围为20‑50％之间，诱导剂为乳糖，发酵时间16h，离心获得湿菌体；d、将获得的湿菌体按照200g/L置于0.1mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中进行重悬，菌悬液使用高压匀质机匀质2‑5次，压力不低于800bar；e、匀质后的破碎液于80℃处理10‑15min，以9000rpm离心5min，去除沉淀杂质，获得上清酶液；S13、共价结合固定化酶：f、混合，将经预处理后的树脂与获得的酶液按1:5‑10的比例混合，在室温下搅拌固定12‑24h；g、过滤，过滤去除混合后的残留酶液，得到γ‑内酰胺酶；所述S2包括，S21，在g得到的γ‑内酰胺酶中加入γ‑内酰胺和去离子水，在40℃进行搅拌反应，进行拆分转化得到(‑)γ‑内酰胺，所述γ‑内酰胺酶与γ‑内酰胺的质量比为1:1；所述S21中γ‑内酰胺的浓度＞300g/L。