[发明专利]一种咖啡因人工抗原的制备方法

摘要

本发明提供了一种咖啡因人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测以3,7‑二甲基黄嘌呤与丁二酸酐为原料进行酰化反应，得到含羧基的中间体，该中间体与3‑氨基二氢噻吩‑2‑酮进行酰化反应后，经水解得到一含巯基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测先将溴乙酸经N‑羟基琥珀酰亚胺活性酯法活化后与牛血清蛋白（BSA）交联，得到含溴代链烃的牛血清蛋白,与第一步得到含巯基的半抗原经缩合反应制备得咖啡因人工抗原即咖啡因‑牛血清蛋白。所制备的咖啡因人工抗原可进行动物免疫，取得相应的咖啡因抗体，可用于各种咖啡因类免疫分析法的研究，为咖啡因的检测提供更加方便快速准确的途径。

主权项

一种咖啡因人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备咖啡因人工半抗原：(a) 将3,7‑二甲基黄嘌呤与丁二酸酐以摩尔比为1:2加入圆底烧瓶中，用吡啶溶解，100℃下回流搅拌反应16小时；反应结束后自然冷却至室温，转干，经薄层色谱分离得到白色固体产物Ⅰ；薄层层析：层析液为95%乙醇:1,4‑二氧六环:二氯甲烷:氨水=8:1 :10 :1，产物Rf=0.4；(b) 将3‑氨基二氢噻吩‑2‑酮盐酸盐与产物Ⅰ以摩尔比为1:1加入圆底烧瓶中，加入少量的吡啶，以N,N‑二甲基甲酰胺为溶剂，再加入1.15倍摩尔比的1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，氮气保护下，室温搅拌反应1小时；反应结束后，将溶剂转干，加入水和二氯甲烷萃取，收集水相，用饱和的碳酸钠溶液调pH=7.0，水相再用氯仿萃取，得到的有机相经无水硫酸镁干燥，过滤，转干，得到油状物，油状物经二氯甲烷提取，转干后得到的残渣用乙酸乙酯溶解，加入1Mol/L含氯化氢的乙醚溶液得到白色悬浮液，过滤，得到的滤渣经干燥得产物Ⅱ；薄层层析：层析液为乙醇，产物Rf=0.6；(c) 将产物Ⅱ用体积比为N,N‑二甲基甲酰胺:双蒸水=7:3的混合溶剂溶解，加入适量浓度为1mol/L的氢氧化钾水溶液，在室温下搅拌反应5分钟，迅速加入磷酸钾缓冲溶液，再用1mol/L的盐酸溶液调pH=7.0，溶液经乙酸乙酯提取，得到含巯基的半抗原Ⅲ；薄层层析：层析液为乙醇，产物Rf=0.3；（2）制备咖啡因人工抗原：(d) 将溴乙酸与N‑羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳酰亚胺以摩尔比为1:1.1:1.1溶于二氯甲烷中，冰水浴中搅拌反应2小时，然后再转至室温继续反应1小时；反应结束，过滤，将滤液转干，将得到的残渣用体积比为二氯甲烷:石油醚=3:1的混合溶剂进行重结晶，得到的固体Ⅳ在真空器皿中干燥，备用；薄层层析：层析液为95%乙醇，产物Rf=0.65；(e) 将固体Ⅳ配制成浓度为64mg/ml的N,N‑二甲基甲酰胺溶液，记作A溶液；配制浓度为20mg/ml的牛血清白蛋白的PBS溶液，记作B溶液；将A液缓慢滴加到搅拌着的B液中，室温搅拌反应2小时；将混合溶液在PBS溶液中透析7次以上，将透析好的溶液经离心后，取上清液，得到的上清液用Lawry法测其浓度，并量其体积，记作C液，备用；(f) 将含巯基的半抗原Ⅲ配置成浓度为25mg/ml的N,N‑二甲基甲酰胺溶液，记作D液；(g) 将D液缓慢滴入C液中，室温下搅拌均匀，静置3小时后，在4℃下，将混合液用PBS溶液透析7次以上；离心后取上清液即得到咖啡因人工抗原：咖啡因‑牛血清白蛋白。