[发明专利]从海参生长环境中分离硝化细菌及微生态制剂的制备方法

摘要

本发明提供从海参生长环境中分离硝化细菌及微生态制剂的制备方法，包括以下步骤(1)选取试样；(2)富集硝化细菌培养；(3)配置纯化分离培养基板；(4)分离纯化硝化细菌培养；(5)菌种鉴定；(6)一次扩大培养；(7)二次扩大培养；(8)制备硝化细菌的微生物制剂。本发明制备过程简便、经济、灵活。本发明直接采用海参生长环境的海水进行富集、纯化硝化细菌。本发明制成硝化细菌微生态制剂有效地解决生化系统中硝化细菌生长缓慢、世代周期长、在传统生化体系与异养菌竞争不占优势、易流失等问题。此外，针对废水中污染物的多样性，菌种来自海参生长环境的生化系统中，自身具有多样性及较强的适应能力。

主权项

从海参生长环境中分离硝化细菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)选取试样：选取海参生长水域的水作为试样，放入容器中；(2)富集硝化细菌培养：首先制备牛肉膏‑蛋白胨固体培养基，高压蒸汽灭菌，将试样与无菌蒸馏水按体积比为1:9的比例放入盛有玻璃珠的容器中，密闭后振荡稀释，得到稀释10倍的样品，然后取稀释后的样品与无菌蒸馏水按同样的比例再次进行振荡稀释，共进行10次，每次稀释倍数为10倍，得到10种不同稀释度的样品，然后将梯度稀释的试样涂布到牛肉膏‑蛋白胨固体培养基上，然后将放置于生化培养箱30℃下培养7‑10天，形成多个菌落；(3)配置纯化分离培养基板：将硫酸铵0.5‑2g、氯化钠0.3‑1g、硫酸亚铁0.03‑0.05g、磷酸二氢钠1‑3g、氯化钙7.5‑9.0g、亚硝酸钠1‑3g、硫酸镁0.03‑0.05g、硫酸锰0.01‑0.04g、磷酸氢二钾0.70‑0.95g、无水碳酸钠1‑2g、蒸馏水1000mL加入到容器中，溶解，pH的范围7.3‑7.5，加入5％琼脂，加热溶解，待培养基冷却至45‑50℃后倾倒至灭菌的培养皿中，静置冷凝成纯化培养基板；(4)分离纯化硝化细菌培养：将步骤(2)中得到的多个菌落的单个菌落接种到纯化分离培养基板上，30℃、通气条件下培养3‑5天，然后，用接种环挑取一菌环细菌菌苔放到无菌水中，充分振荡，将此细菌悬液，按照活菌数测定方法在平板上涂布，使其在培养皿上形成30‑50个孤立的菌落，然后将孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，如此反复3‑4次；(5)菌种鉴定：对菌株的细胞形态特征、生理生化特征进行测定；并且用二苯胺检测后出现蓝色，该菌株属于硝化细菌菌种；(6)一次扩大培养：将步骤(6)得到的纯化的硝化细菌的菌种接种于10L的种子发酵罐培养，一次扩大培养液为5L，130℃灭菌30分钟，培养温度为30℃，通气，培养2‑3天，得到一次扩大培养的硝化细菌的菌体；(7)二次扩大培养：将一次扩大培养的硝化细菌的菌体接种于100L种子发酵罐培养，二次扩大培养液为100L，二次扩大培养液的组分与步骤(6)相同，130℃灭菌30分钟，培养温度为30℃，通气，培养48h，得到二次扩大培养的硝化细菌的菌体。