[发明专利]一种树鼩精子活力评价的荧光染色法

摘要

一种树鼩精子活力评价的荧光染色法，通过以下步骤实现：（1）TALP-HEPES洗精液的配制，（2）精液采集，（3）精液洗涤，（4）染色，（5）显微镜检测；本发明利用Hoechst 333422和PI对死活精子反应的不同及其可被同一波长激光激发出荧光的特点，对树鼩精子进行荧光染色，不用切换光源就可准确地检测精子活力；而且由于这二种染料在激光激发后分别发红色和蓝色荧光，故在检测活力的同时还可引入发绿色荧光的染料进行精子顶体完整性的检测，借助荧光显微镜或流式细胞仪对树鼩精子活力及顶体完整性做出准确检测。

主权项

一种树鼩精子活力评价的荧光染色法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）TALP‑HEPES洗精液的配制按每100mL溶液中含氯化钠742 mg、氯化钾23.6 mg、二水氯化钙29.4 mg、六水氯化镁10.2 mg、葡萄糖90.1 mg、磷酸二氢钠4.8 mg、碳酸氢钠16.8 mg、丙酮酸钠1.1 mg、酚红1 mg、HEPES钠130.2 mg、HEPES酸119.2 mg、乳酸钠60%水溶液185 μL、庆大霉素5 mg和牛血清白蛋白300 mg的配比，用Milli‑Q超纯水混合均匀，用NaOH 或HCl调节pH至7.4，制成TALP‑HEPES洗精液；（2）精液采集通过外科手术从树鼩睾丸中分离出附睾尾和输精管,用TALP‑HEPES洗精液冲洗附睾并去除血液和脂肪组织, 随后将附睾尾置于含1mL 37 ℃ TALP‑HEPES洗精液的小离心管中, 用精细手术剪剪碎附睾尾, 继续于37 ℃孵育10 min 让精子游出；（3）精液洗涤用精细镊子夹出附睾组织，小心将精子吸至另一4mL离心管中，加入2mL 37 ℃ TALP‑HEPES洗精液于250g, 离心5 min，洗2次, 弃上清, 沉淀用37 ℃ TALP‑HEPES洗精液重悬；（4）染色取1mL洗涤后的精液，分别加入2μL H342和8μL PI，37℃温浴15min；（5）显微镜检测取8μl染色后的精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数。