[发明专利]一种基于多重循环延伸连接的靶基因区域富集新方法

摘要

本发明提供了一种基于多重循环延伸连接的靶基因区域富集新方法，实验结果表明，该方法可以实现多重目的基因的基因片段富集，目的基因片段数可以是数十至数万。多重目的基因片段的富集产物可以通过修饰及纯化定量后用于各种二代测序平台的测序分析。

主权项

一种核酸片段的富集方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)提供一反应体系所述反应体系中至少包括：待测样本、n个探针组、核酸聚合酶和核酸连接酶；所述n≥2，各个探针组中分别包含第一探针和第二探针；所述第一探针和所述第二探针分别与同一条目标核酸片段的3’端和5’端特异性杂交(所述特异性杂交是指至少部分互补或完全互补)；所述第一探针不能被5'端方向核酸外切酶降解；所述第二探针不能被3'端方向核酸外切酶降解；所述第一探针包括与目标核酸片段3'端特异性杂交的第一部分和与后续PCR扩增引物序列相对应的第二部分(所述相对应是指所述第二部分的反向互补序列与PCR扩增引物能够特异性杂交)；所述第二探针包括与目标核酸片段5’端特异性杂交的第一部分和与后续PCR扩增引物序列特异性杂交的第二部分；当所述所述第一探针和所述第二探针与同一目标核酸片段特异性杂交时，所述第一探针的3'末端与所述第二探针的5'末端至少间隔1个核苷酸的距离；(2)杂交和延伸连接所述第一探针和所述第二探针在高温变性、退火过程中与所述待测样本的目标核酸片段特异性杂交，在所述核酸聚合酶作用下，所述第一探针沿所述目标核酸片段进行DNA链延伸，延伸至所述第二探针的5'末端时被其阻滞，获得第一探针延伸DNA链；以及在所述核酸连接酶的作用下，将所述第一探针延伸DNA链3'端与所述第二探针5'端连接，从而形成含连接产物的反应混合物；和任选地重复上述“变性‑退火‑延伸‑连接”，从而增加所述反应混合物中所述连接产物的数量；(3)消化对步骤(2)的所述反应混合物，用核酸外切酶进行消化处理，从而获得经消化的反应混合物，所述反应混合物中含有未被消化的所述连接产物；(4)富集以步骤(3)的所述未被消化的所述连接产物为模板，进行PCR扩增，从而获得PCR扩增产物，即为富集的核酸片段。