[发明专利]一种裂盖马鞍菌人工菌种的分离培养方法

摘要

本发明提供了一种裂盖马鞍菌人工菌种的分离培养方法，该方法包括裂盖马鞍菌子实体和基质的原产地采集和收集、子实体的辐照处理和组织分离、菌丝体的平板培养和种瓶培养等步骤。优选地，在裂盖马鞍菌人工菌种分离培养的步骤中还包括对裂盖马鞍菌子实体组织分离前进行就地的一次无菌处理和运返实验室的二次无菌处理的步骤，经过上述处理可获得裂盖马鞍菌人工纯菌种。

主权项

一种裂盖马鞍菌人工菌种的分离培养方法，其特征在于：裂盖马鞍菌子实体和生长基质的原产地采集和收集：五一期间是新疆裂盖马鞍菌大量发生、子实体发育成熟的季节，赶赴距巴楚县城30余公里的夏河和夏玛勒胡杨林场跟随当地采菇经验丰富的维吾尔族老乡深入林间寻找发育成熟的裂盖马鞍菌子实体，用经过121℃灭过菌的大镊子从沙土中夹取出裂盖马鞍菌子实体，用吹风机对附着在子实体上的沙土进行清理，清理干净后再用医用剪刀将裂盖马鞍菌带有泥土的须根剪除，并将菌盖和菌柄剪开，将菌柄投入装有80mL 75％酒精的150mL三角瓶中杀菌3min，然后用镊子将菌柄捞出与菌盖分别放入事先准备好的无菌空白培养皿中，并一起放入四周装有冰袋的苯板保鲜箱中，最后用聚丙烯袋收集子实体发生地周围的生长基质，并用标记笔在培养皿、袋体上做上一一对应的编号、时间、采集地、采集人等信息，其它子实体和生长基质的采集和收集方法同上；子实体的辐照处理和组织分离：将上述经过就地无菌处理并于第二天运返实验室装有裂盖马鞍菌菌柄和菌盖的培养皿置于60Coγ源辐照室分别用1.0KGy和0.5KGy的剂量进行辐照处理，然后移至接种室静置2h后在超净工作台上对菌柄进行组织分离，在酒精灯火焰的保护下将装有菌柄的培养皿盖打开呈45度角并用医用剪刀在裂盖马鞍菌菌柄中部剪取组织块；菌丝体的平板培养：用无菌接种钩分别挑取经医用剪刀分离的裂盖马鞍菌菌柄中部组织块一一接种于装有优化平板培养基的培养皿中心处，置于人工气候箱中25℃恒温培养12h、20℃恒温培养12h，以此类推培养10d，挑选菌丝体活力旺盛、长势良好的平板置于冰柜4℃低温保藏以备后续研究之用，其中，优化平板培养基的质量体积百分比为：马铃薯煮汁20％、麸皮煮汁1.5％、蔗糖2.0％、蛋白胨1.0％、KH2PO4 0.2％、MgSO4 0.15％、琼脂1.8％，其余为自来水，pH值灭菌前8.5，121℃灭菌30min；菌丝体的种瓶培养：用无菌接种钩挑取1朵经辐照处理的裂盖马鞍菌菌盖，接种到装有350mL种瓶培养基的500mL广口瓶中，置于人工气候箱中将1d每隔6h设为一段，对应的培养温度分别设为27℃、23℃、19℃、15℃，如是仿生变温培养30d，挑选菌丝体长势旺盛的种瓶置于冰柜4℃低温保藏以备后续栽培之用，其中，种瓶培养基的质量体积百分比为：裂盖马鞍菌发生基质27％、木屑粉10％、麸皮6.7％、白砂糖1.0％、KH2PO4 0.2％、MgSO4 0.1％、，其余为自来水，pH值灭菌前8.5，121℃灭菌30min。