[发明专利]一种辅酶Q10发酵工艺及控制策略

摘要

本发明提供了一种辅酶Q10发酵工艺及控制策略。采用类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)发酵生产辅酶Q10，提供了辅酶Q10发酵的具体操作方法，建立了工艺调控的标准，通过观察发酵过程中菌型变化，以菌型过渡期作为判断工艺参数调整的时间及幅度的依据，辅酶Q10发酵水平有了大幅度的提升，生产水平稳定，降低发酵成本。

主权项

1.一种辅酶Q10发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)菌种传代：采用平板培养进行菌种传代，从平板上挑取外观圆润、边缘光滑、颜色较深的单菌落装于有10～14mL无菌水试管后充分打散，稀释到一定梯度后吸取少量菌液于平板上进行涂布，于32～34℃培养5～7天；/n2)母瓶培养：从平板上挑取25～30个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的单菌落于装有10～14mL无菌水试管充分打散，每个母瓶接2.3～3.2mL菌悬液，培养条件为转速220～240rpm，温度32～34℃，培养25～30h；/n3)一级种子培养：待母瓶残糖降至0.5～1.5g/L时按接种量5～10％接入一级种子罐中，一级种子罐培养条件为罐压0.03～0.04MPa，vvm 0.6～0.8，罐温为32～34℃，转速180～220rpm，培养周期16～24h；/n4)二级种子培养：待一级种子残糖降至0.5～1.5g/L时按接种量为5～10％接入二级种子罐，二级种子罐培养条件为罐压0.03～0.04MPa，vvm 0.6～0.8，罐温为32～34℃，转速180～220rpm，培养周期16～24h；/n5)三级发酵培养：待二级种子残糖降至0.5～1.5g/L时按接种量为5～10％接入三级发酵罐中，三级发酵罐初始培养条件为0.03～0.035MPa，转速60～70rpm，vvm 0.42～0.46，罐温32～34℃，初始糖浓度10～15g/L，磷浓度0.3～0.4g/L，接种后每隔四个小时取样测糖、磷并镜检观察菌型，前40h糖控制7～12g/L，磷0.2～0.3g/L，后期至发酵结束糖控制3～6g/L，磷控制0.1～0.15g/L，通过补加液氨控制pH 7.0～7.4；/n发酵初期，菌型为小球，菌体出现二分裂时vvm提高至0.48～0.54，在菌体有出现短棒状时vvm提至0.54～0.6，罐压0.035～0.04Mpa，转速提高至75～90rpm，待菌型由短棒状开始转为弯形时提高通气比至vvm 0.6～0.68，罐压为0.45～0.5Mpa，转速提高至95～105rpm，待菌型由弯形转变为大圆球形时vvm降低至0.52～0.58，罐压降至0.035～0.04Mpa，待辅酶Q10含量增长减缓，糖耗速度明显减慢，菌体染色浅，残糖＜0.5～1.5g/L后停止发酵；/n其中，采用的菌种为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，已于2010年12月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.4497；/n所述的平板培养基组分为：葡萄糖2.0～4.0g/L，酵母粉1.0～3.0g/L，蛋白胨1.0～3.0g/L，琼脂粉20～30g/L，消前pH6.8～7.2，于121℃灭菌25～30min；/n所述的母瓶培养基的组分为：氯化铵1.7～2.5g/L，蛋白胨0.7～1.5g/L，味精0.4～1.2g/L，玉米浆0.4～1.2g/L，葡萄糖2～6g/L，磷酸氢二钠0.35～0.55g/L，磷酸二氢钠0.35～0.55g/L，三氯化铁0.08～0.12g/L，硫酸镁1.4～2.2g/L，氯化钾1.4～2.2g/L，硫酸铜0.02～0.06g/L，氯化锌0.0006～0.00014g/L，碳酸氢钙5.6～7.2g/L，辅液I；其中辅液I组分为：盐酸硫胺1～3g/L，核黄素1.8～2.4g/L，吡哆素10～15g/L，叶酸0.5～1.5g/L，烟酸12～16g/L，烟酸胺12～16g/L，泛酸钙0.2～0.6g/L，苯丙氨酸0.4～1.2g/L，茄尼醇4～8g/L；除辅液I之外于121℃灭25～30min，辅液I于118℃灭20～25min，按体积比0.2～0.6％加到母瓶培养基中；/n一级种子培养基组分为：氯化铵2～4g/L，蛋白胨0.8～1.6g/L，味精0.6～1.8g/L，玉米浆0.6～1.8g/L，葡萄糖4.8～9.6g/L，磷酸氢二钠0.4～0.8g/L，磷酸二氢钠0.4～0.8g/L，三氯化铁0.08～0.14g/L，硫酸镁1.6～3.2g/L，氯化钾1.6～2.4g/L，硫酸铜0.02～0.06g/L，氯化锌0.0006～0.00014g/L，碳酸氢钙5.6～7.2g/L，辅液II；其中辅液II组分为：盐酸硫胺10～15g/L，核黄素0.5～1.5g/L，吡哆素1.5～2.5g/L，叶酸0.25～0.75g/L，烟酸6～12g/L，烟酸胺6～12g/L，泛酸钙0.15～0.45g/L，苯丙氨酸0.2～0.6g/L，茄尼醇3～9g/L；消前用液氨将一级培养基初始pH调至6.4～6.7，除辅液II之外于121℃灭25～30min后降至培养温度并通空气保压，辅液II装容器于118℃灭20～28min；/n二级种子培养基组分为氯化铵2.6～3.8g/L，蛋白胨1.6～3.2g/L，味精0.6～1.2g/L，玉米浆0.6～1.2g/L，葡萄糖10～15g/L，磷酸氢二钠0.6～1.2g/L，磷酸二氢钠0.6～1.2g/L，三氯化铁0.15～0.25g/L，硫酸镁3～6g/L，氯化钾1.6～2.4g/L，硫酸铜0.02～0.06g/L，氯化锌0.0005～0.0015g/L，碳酸氢钙5.6～7.2g/L，辅液III；其中辅液III组分为盐酸硫胺10～20g/L，核黄素1.5～3g/L，吡哆素2～4g/L，叶酸0.4～1.0g/L，烟酸15～25g/L，烟酸胺15～25g/L，泛酸钙0.001～0.004g/L，苯丙氨酸0.002～0.006g/L，茄尼醇0.04～0.08g/L；消前用液氨将二级种子培养基初始pH调至6.4～6.7，除辅液III之外于121℃灭25～30min后降至培养温度并通无菌空气保压，辅液III放入小罐中于120℃灭20～25min；/n三级培养基组分为氯化铵3.6～4.8g/L，蛋白胨0.6～1.2g/L，味精2.0～6.0g/L，玉米浆3.0～6.0g/L，葡萄糖10～15g/L，磷酸二氢钠2.5～3.5g/L，三氯化铁0.8～1.4g/L，硫酸镁6～9g/L，氯化钾1.5～3.0g/L，硫酸铜0.06～0.12g/L，辅液IV；其中辅液IV组分为：盐酸硫胺1～3g/L，核黄素1.8～2.4g/L，吡哆素10～15g/L，叶酸0.5～1.5g/L，烟酸12～16g/L，烟酸胺12～16g/L，泛酸钙0.15～0.45g/L，苯丙氨酸0.25～0.75g/L，茄尼醇2.5～5g/L，三级培养基于121～122℃灭菌25～30min，辅液IV于120～121℃灭20～25min。/n