[发明专利]用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化

摘要

本发明提供了用于操纵序列和/或靶序列的活性的系统、方法、和组合物的递送、工程化和优化。提供了载体和载体系统、以及用于设计和使用此类载体的方法，其中这些载体和载体系统中的一些编码CRISPR复合物的一种或多种组分。还提供了在原核和真核细胞中引导CRISPR复合物形成以确保增强对靶识别的特异性并避免毒性的方法。

主权项

一种修饰细胞中的感兴趣基因组座位的方法，该方法包括递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含串联指导RNA构建体，该构建体包含：I.CRISPR‑Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含：(a)第一指导序列，该第一指导序列能够杂交到该第一靶序列上，(b)第一tracr配对序列，(c)第一tracr序列，(d)第二指导序列，该第二指导序列能够杂交到该第二靶序列上，(e)第二tracr配对序列，和(f)第二tracr序列，以及II.编码CRISPR酶的多核苷酸序列，该CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列(NLS)，其中该多核苷酸序列包含在该第一tracr序列与该第二指导序列之间的接头序列，由此该第一指导序列和该第二指导序列是串联的，其中在转录时，该第一tracr配对序列和该第二tracr配对序列分别杂交到该第一tracr序列和该第二tracr序列上，并且该第一指导序列和该第二指导序列分别引导第一CRISPR复合物和第二CRISPR复合物与该第一靶序列和第二靶序列的序列特异性结合，其中该第一CRISPR复合物包含与(1)杂交到该第一靶序列上的该第一指导序列、和(2)杂交到该第一tracr序列上的该第一tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中该第二CRISPR复合物包含与(1)杂交到该第二靶序列上的该第二指导序列、和(2)杂交到该第二tracr序列上的该第二tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中编码CRISPR酶的多核苷酸序列是DNA或RNA，并且其中该第一指导序列引导邻近该第一靶序列的DNA双链体的一条链的切割，并且该第二指导序列引导邻近该第二靶序列的另一条链的切割，从而诱导双链断裂，由此修饰该基因组座位。