[发明专利]制造腺病毒和相应质粒的方法

摘要

本公开涉及制造包含一部分或全部的腺病毒基因组和一个或多个允许所述腺病毒基因组的快速和灵活操纵的原始限制性位点的腺病毒质粒的方法，和制备例如包含转基因的腺病毒构建体的方法。本公开还扩展至在所述方法中使用和由所述方法产生的新型中间体，所述方法的质粒和穿梭载体以及可从所述质粒和/或方法获得的腺病毒或腺病毒载体。本公开还涉及例如从本文公开的方法获得的病毒或载体在疗法中的用途，例如在癌症治疗中的用途。

主权项

1.一种制备包含选择标记基因、低拷贝细菌复制起点和腺病毒基因组的穿梭载体的方法，所述腺病毒基因组包含5'ITR、3'ITR和L5基因，所述方法包括如下步骤：/na)制备包含相等比例的以下三个片段的腺病毒穿梭载体：/ni)包含选择标记基因和低拷贝细菌复制起点的载体片段，其中所述载体片段的5'端起始于第一限制性酶位点并且在所述载体片段的3'端终止于第二限制性酶位点，/nii)包含所述腺病毒基因组的5'端的5'臂，所述腺病毒基因组包括所述5'ITR，其中所述5'臂的所述5'端起始于第二限制性酶位点并且在所述5'臂的所述3'端终止于第三限制性酶位点，/niii)包含所述腺病毒基因组的3'端的3'臂，所述腺病毒基因组包括所述3'ITR和所述L5基因，其中所述3'臂的所述5'端起始于第三限制性酶位点并且在所述3'臂的所述3'端终止于第一限制性酶位点，/n和进行一步三元连接以：/n在所述第一限制性酶位点将所述3'臂的所述3'端接合至所述载体片段的所述5'端，/n在所述第二限制性酶位点将所述载体片段的所述3'端接合至所述5'臂的所述5'端，和/n在所述第三限制性酶位点——至少所述L5基因，将所述5'臂的所述3'端接合至所述3'臂的所述5'端，/n以形成布置成如下的环化穿梭载体：第一限制性酶位点，接着是载体片段，接着是第二限制性酶位点，接着是5'臂，接着是第三限制性酶位点，接着是3'臂，/nb)将至少一个原始限制性位点和/或转基因引入所述穿梭载体中介于所述L5基因与选自包含E3位点、E4位点或所述位点两者的群组的位点之间的位置中。/n