[发明专利]一种籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法

摘要

本发明公开了一种籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，该育种新方法的步骤如下（1）选取待改良粳稻品种/系和抗纹枯病籼稻抗源；（2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐性浓度的鉴定；（3）杂交育种获得三交F1杂交种；（4）对三交F1杂交种进行排籼培养基花药培养；（5）大田种植花培苗，单株收种获得纹枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花培家系进一步大田播种，以待改良粳稻品种/系亲本为对照，筛选获得农艺形状良好且纹枯病抗性得到改良的粳稻新品系。本发明的育种新方法能够将籼稻抗纹枯病基因特定而高效地渗入粳稻，3年左右即可完成抗纹枯病育种，显著缩短常规籼粳交抗纹枯病育种周期，具有较大的育种应用价值。

主权项

一种籼粳交基因渐渗抗纹枯病育种新方法，其特征在于：该育种新方法的步骤如下：（1）选取待改良粳稻品种/系和抗纹枯病籼稻抗源：选取农艺性状良好的粳稻品种/系并对选取的粳稻品种/系进行排籼培养基的诱导培养，最终选定花药愈伤组织诱导率高于25%的粳稻品种/系作为待改良粳稻品种/系，选取农艺性状良好且含有纹枯病高抗基因的籼稻品种/系作为抗纹枯病籼稻抗源；（2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐性浓度的鉴定：分别在分化培养基中加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，对步骤（1）中选定的待改良粳稻品种/系的花药愈伤组织进行分化培养，并选择合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为粳稻花药培养粗毒素选择压浓度；（3）杂交育种获得三交F1杂交种：将大田种植筛选的抗纹枯病籼稻抗源与广亲和材料籼粳架桥获得杂交种F1，选取杂交种F1的花药再与待改良粳稻品种/系杂交获取杂交种三交F1；（4）对三交F1杂交种进行排籼培养基花药培养：三交F1杂交种正季播种，选取健壮主穗花药进行排籼培养基花药诱导培养，获得花药愈伤组织，并挑选直径0.4～0.8cm的花药愈伤组织接种于添加了选择压浓度粗毒素的分化培养基，在温度27～29℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行生根培养，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田；（5）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、纹枯病抗性筛选获得改良的粳稻新品系：大田种植花培苗，单株收种获得纹枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花培家系进一步大田播种，以待改良粳稻品种/系亲本为对照，筛选获得农艺性状良好且纹枯病抗性得到改良的粳稻新品系；所述步骤（1）中选取的农艺性状良好的粳稻品种/系进行排籼培养基的诱导培养的过程如下：（1.1）取材与预处理：将选取的农艺性状良好的粳稻品种/系大田常规栽培，取叶枕距为5～7cm、穗色呈淡黄绿色、花药淡黄色且长度为颖壳的1/3～1/2、孕穗不裂开的健壮主穗为供试材料，保留2～3张叶片，75%酒精擦拭表面后，用湿毛巾包裹且外套塑料袋，置4℃下低温预处理3天；（1.2）接种：预处理后，将含主穗的稻苞剪下，然后将该稻苞浸泡于75%的酒精中处理3～4min，接着将该稻苞转移于超净工作台中剥离主穗，进一步剥取小穗为大小均匀的小支梗，接下来用消毒过的纱布包裹小支梗后用浓度为0.1%的升汞灭菌10min，无菌水漂洗3～4次，打开纱布晾干，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于排籼培养基；（1.3）诱导培养：将排籼培养基置于24～26℃的黑暗环境中诱导愈伤组织，30～40天后在花药的边缘出现白‑淡黄色的无定型细胞团，并在花药接种培养50天后统计花药愈伤组织诱导率，选定花药愈伤组织诱导率高于25%的农艺性状良好的粳稻品种/系作为待改良粳稻品种/系；所述步骤（1.2）中的排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4‑D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，排籼培养基的pH值为5.8；所述步骤（2）中的粗毒素耐性浓度鉴定过程如下：（2.1）粗毒素的制备：将混合纹枯病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，27℃下培养至菌丝长满平板，从平板菌落边缘取直径为5mm的5块菌丝块至50mL产毒培养基中，27℃暗培养15d，每天人工振荡2次，15天后将培养滤液加热，产生的白色沉淀用滤纸过滤，在滤液中加入30g活性炭，4℃静置吸附12h，然后8500r/min离心15min，再将活性炭沉淀用等体积甲醇洗脱，洗脱液60℃下旋转蒸发浓缩，获得的黄色浆状物即为水稻纹枯病菌粗毒素；（2.2）对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐力浓度鉴定：分别在分化培养基中加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，然后将步骤（1）中选定的待改良粳稻品种/系诱导培养的花药愈伤组织转移进分化培养基，诱导培养30～40天后统计愈伤组织分化率，并选择合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为粳稻花药培养粗毒素选择压浓度；所述步骤（2.1）中的马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方为：马铃薯200g/L+葡萄糖20g/L+琼脂粉12g/L，pH值自然；产毒培养基配方为：KNO310g/L+KH2PO45g/L+MgSO4·7H202.5g/L+Fe2(SO4)30.02g/L+蔗糖45g/L，pH值为6.5；所述步骤（2.2）中的分化培养基配方为：MS基本培养基+2mg/L6‑BA+0.2mg/LNAA+梯度浓度粗毒素提取液，分化培养基的pH值为6.0；所述步骤（4）中的排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/L2,4‑D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，排籼培养基的pH值为5.8；分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+蔗糖3%+琼脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5mg/L+水解蛋白1g/L+合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液，分化培养基的pH值为5.8；生根培养基配方为：1/2Ms大量+Ms微量+Ms有机物+蔗糖3%+琼脂0.8%，生根培养基的pH值为5.8；所述步骤（2.2）中的合适筛选压力水平浓度是指选定的待改良粳稻品种/系诱导培养的花药愈伤组织在含有粗毒素的分化培养基中的分化率为0.8%～1.2%时的粗毒素浓度。