[发明专利]利用转座子介导外源基因导入螺旋藻的方法

摘要

利用转座子介导外源基因导入螺旋藻的方法，涉及一种基因工程。以NCBI上已知的蓝藻的序列设计多组引物IS1～IS4，从蓝藻上克隆转座子元件即插入序列；供体质粒pEGFP-IS-IS-Km的超声转化和筛选：用EcoR Ⅰ酶切pEGFP-IS-IS-Km，获得线状质粒，两端各有一个IS序列，转化螺旋藻869s，以GFP和G418(nptII)筛选出插入突变的螺旋藻株。构建了包含gfp基因、nptII标记基因及转座子序列的螺旋藻整合筛选系统，以利用转座子随机插入突变来影响螺旋藻基因结构进而改变螺旋藻品质。可应用于螺旋藻突变文库的构建，还可进行外源基因的导入和表达，以及螺旋藻内源基因的反义抑制调控。

主权项

利用转座子介导外源基因导入螺旋藻的方法，其特征在于其具体步骤如下：1)以NCBI上已知的蓝藻的序列设计多组引物IS1、IS2、IS3、IS4，从蓝藻上克隆出最简单的转座子元件即插入序列(IS)，其序列如下：第一组：IS1‑1:5‑ATTGCGGCCGCTTTCGACAACGTTA‑3Not ⅠIS1‑2:GATCGATCCCTGGCGGTTCATAGTGCla ΙIS1‑3:5‑GGAATTCCTAGGCCACTGACT‑3EcoR I第二组：IS2‑1:5‑GATCGATTATACAATAGCCATAC‑3Cla ΙIS2‑2:5‑TAGCGGCCGCTGGTAGTTGGTTGTG‑3Not ⅠIS2‑3:5‑ACAGTGAGGAATTCTTAAGAGAACG‑3EcoR I第三组：IS3‑1:5‑TAGCAATCGATAGAACACTTAGGAC‑3Cla ΙIS3‑2:5‑TAGCGGCCGCACAGAACACTTAGGAC‑3Not ⅠIS3‑3:5‑TAGGAATTCGTCAAGGTGGTTAG‑3EcoR I第四组：IS4‑1:5‑GGCGTTATCGATTTAGGGTATGATT‑3Cla ΙIS4‑2:5‑GGCGGCCGCTGATTTAGGGTATGATT‑3Not ⅠIS4‑3:5‑GGCGTTGCTGAATTCAGGTATGATT‑3EcoR I其中在IS序列的上游引物分别设置了Not Ⅰ和Cla Ι位点，下游引物设置了EcoR Ⅰ酶切位点，以蓝藻染色体为模板，分别以第一条和第三条引物，第二条和第三条引物，利用PCR技术扩增出插入序列，扩增的两种产物大小都约为1.0kb；随后，将扩增的第一个插入序列片段经EcoR Ⅰ/Not Ι双酶切回收IS序列，并与经EcoR Ⅰ/Not Ι双酶切的实验室原有的质粒载体pEGFP‑recA‑KET4连接，连接产物转化E.coli DH5α，以氨苄青霉素和卡那霉素筛选克隆子，得重组质粒pEGFP‑IS；用EcoR Ⅰ和Cla Ⅰ双酶切PCR扩增的片段后，电泳回收片段，将重组质粒pEGFP‑IS用EcoR Ⅰ和Cla Ⅰ双酶切，回收；然后将两回收片段连接，连接产物转化感受态E.coli DH5α，以氨苄青霉素和卡那霉素筛选克隆子，获得包含有两个插入序列、gfp基因、nptII标记基因和Ap标记基因的螺旋藻整合筛选质粒pEGFP‑IS‑IS‑Km；2)供体质粒pEGFP‑IS‑IS‑Km的超声转化和筛选：用EcoR Ⅰ酶切pEGFP‑IS‑IS‑Km，获得线状质粒，两端各有一个IS序列，与转座子特征结构类似，超声转化法转化螺旋藻869s，以GFP和G418(nptII)筛选出插入突变的螺旋藻株。