[发明专利]一种以富马酸为原料多酶偶联制备DL-丙氨酸的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以富马酸为原料多酶偶联制备DL‑丙氨酸的方法。该制备方法以富马酸为原料，将分别含有天冬氨酸酶、天冬氨酸‑β‑脱羧酶和丙氨酸消旋酶的菌体细胞或该三种酶的粗酶液与一定浓度的富马酸铵水溶液混合，在25℃～55℃，pH 6～8进行酶促反应，利用等电点结晶或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度的DL‑丙氨酸。该方法采用多酶偶联生物转化技术高效制备DL‑丙氨酸，具有原料来源广、生产工艺操作简便、酶促转化时间短和生产成本低等优点。

主权项

一种以富马酸为原料多酶偶联制备DL‑丙氨酸的方法，其特征是该方法为：(1)将具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌Escherichia coli、具有天冬氨酸‑β‑脱羧酶活性的徳阿昆哈假单胞菌Pseudomonas dacunhae和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum分别在培养基中培养，产生高酶活天冬氨酸酶、天冬氨酸‑β‑脱羧酶和丙氨酸消旋酶；培养基碳源采用葡萄糖或麦芽糖或蔗糖或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～30g/L，氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米浆或蛋白胨或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30g/L；(2)取具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌湿菌体0.7g，具有天冬氨酸‑β‑脱羧酶活性的徳阿昆哈假单胞菌湿菌体10g和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒杆菌湿菌体10g，加入到1000mL转化液中，转化液中含200g/L富马酸、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.2g/L TritonX‑100，pH 6.0，40℃酶促反应24h，反应液旋光为0， 反应结束后转化液中DL‑丙氨酸浓度为147.3g/L，对富马酸摩尔转化率为96％；(3)将转化液4000r/min离心15min去除菌体，上清液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，脱色液经过超滤和纳滤净化处理，净化液真空浓缩至280mL，冷却结晶到室温，抽滤、烘干得固体DL‑丙氨酸100.5g；(4)将结晶母液稀释后通过732型阳离子交换树脂柱分离，用3％氨水洗脱DL‑丙氨酸饱和吸附柱，收集含DL‑丙氨酸的洗脱液700mL，活性炭脱色后真空浓缩至180mL，趁热加入二倍体积95％乙醇，室温冷却结晶，抽滤、烘干得固体DL‑丙氨酸31.5g，结晶母液回收乙醇后循环套用， 两次结晶共得DL‑丙氨酸132g，收率89.6％。