[发明专利]一种酿酒酵母基因表达系统及其构建与应用

摘要

一种整合型酿酒酵母基因表达系统，包括一种表达载体，所述表达载体从5’‑3’依次包括以下可操作性元件：pMD19‑Tsimple质粒骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、外源基因插入酶切位点以及转录终止子；所述筛选标记基因表达盒包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。所述酵母为酿酒酵母。本发明的表达载体可实现在酿酒酵母中的整合型稳定表达，对酿酒酵母的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。

主权项

1.一种整合型酿酒酵母基因表达系统，包括酿酒酵母以及一种表达载体，其特征在于所述表达载体的构建方法为：根据Spathaspora passalidarum全基因组序列，调取Spathaspora passalidarum 18s rDNA部分序列作为同源重组位点；以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P1和P2进行PCR扩增获得18s rDNA同源重组序列，同时在片段上游引入酶切位点EcoR I，下游引入酶切位点Bgl II、BamH I和Kpn I；将PCR产物纯化后克隆至质粒pMD19‑Tsimple，获得重组质粒pMD‑18s rDNA；以pRS303H质粒DNA为模板，以引物P3和P4进行PCR扩增获得片段hph‑ScCYC1T，同时在片段上游引入BamH I、Pst I，下游引入Kpn I；将纯化的PCR产物和重组质粒pMD‑18s rDNA分别用BamH I和Kpn I双酶切，酶切产物连接获得重组质粒PR‑hph；以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P5和P6进行PCR扩增获得SpTEF1P启动子，同时在片段两端引入酶切位点BamH I和Pst I；将纯化的PCR产物和重组质粒PR‑hph分别用BamH I和Pst I双酶切，酶切产物连接获得重组质粒PRTH；以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P7和P8进行PCR扩增获得SpADHP启动子；以引物P9和P10进行PCR扩增获得SpXYLP启动子；同时在片段的上游引入酶切位点Bgl II，下游引入酶切位点Sal I和BamH I；将纯化的PCR产物和重组质粒PRTH分别用Bgl II和Sal I双酶切，将酶切的重组质粒和PCR产物连接获得重组质粒PRATH和PRXTH；以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P11和P12进行PCR扩增获得SpCYC1T终止子；以引物P13和P14进行PCR扩增获得SpXYLT终止子；在片段上游引入酶切位点Sal I和Not I，在片段下游引入酶切位点BamH I；将纯化的PCR产物和重组质粒PRATH与PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，酶切产物连接获得PR系列重组质粒PRACTH、PRAXTH、PRXCTH和PRXXTH；所述引物P1‑P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13‑14所示；所述引物P5‑P14的核苷酸序列如SEQ ID NO17‑26所示。