[发明专利]一种基于同源重组的乳酸片球菌DQ2的无标记基因敲除方法

摘要

本发明涉及一种基于同源重组的乳酸片球菌DQ2的无标记基因敲除方法，步骤包括温度敏感型穿梭质粒pSET4E和含有所要敲除靶基因上下游同源片段的敲除质粒的构建，敲除质粒电转化进入乳酸片球菌，发生第一次同源重组单交换和发生第二次同源重组双交换突变株的筛选和鉴定。该发明首先实现了乳酸片球菌的无标记基因敲除，获得的敲除菌株不携带任何抗性基因，既可以作为出发菌株进行后续基因敲除和改造，还可以安全用于大规模工业生产。利用该方法分别敲除了乳酸片球菌DQ2(保藏号为CGMCC NO.7471)的L-乳酸脱氢酶基因和D-乳酸脱氢酶基因，得到的敲除菌株分别命名为乳酸片球菌ZP26、TY112，其保藏号分别为CGMCC NO.8665和CGMCC NO.8664，它们能够分别产生光学纯的D-乳酸、L-乳酸。

主权项

一种基于同源重组的乳酸片球菌DQ2的无标记基因敲除方法，步骤包括：(1)pSET4E质粒的构建：pSET4S质粒是一种温度敏感型大肠杆菌‑革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型质粒，37℃下该质粒可在大肠杆菌中复制，但是在一些链球菌如猪链球菌、马链球菌、停乳链球菌中会很快丢失；pSET4S质粒含有壮观霉素抗性基因，而乳酸片球菌DQ2对壮观霉素具有很高的抗性，但对红霉素非常敏感，因此用红霉素抗性基因取代pSET4S的壮观霉素抗性基因得到pSET4E质粒；(2)将要敲除的靶基因上下游同源片段各约1kb分别克隆至pSET4E上，获得靶基因的敲除质粒；(3)将敲除质粒通过电转化进入乳酸片球菌DQ2中，得到含敲除质粒的菌株；(4)将含敲除质粒的菌株在质粒复制受阻的较高温度42℃下培养，在含红霉素的选择平板上筛选发生第一次同源重组即质粒整合到受体菌染色体上的单交换子；(5)将单交换子在无红霉素且较低温度28℃下培养，连续转接1‑10次并在同样条件下培养，直至筛选得到发生第二次同源重组无红霉素抗性实现靶基因敲除的菌株；其特征是：步骤(1)所述的pSET4E质粒的构建方法是：用红霉素抗性基因取代pSET4S的壮观霉素抗性基因；以pMG36e质粒(SEQ ID NO:1)作为模板，设计引物Emr‑F(SEQ ID NO:2)和Emr‑R(SEQ ID NO:3)PCR扩增红霉素抗性基因Emr(SEQ ID NO:4)；分别用限制性内切酶Spe I对Emr基因片段以及质粒pSET4S进行单酶切，为了避免连接过程中单酶切的质粒片段发生自连，对单酶切后的质粒进行去磷酸化处理，之后将目的基因片段与质粒进行连接，转化大肠杆菌XL1‑blue，利用引物Emr‑F和Emr‑R进行PCR验证，同时酶切验证得到正确质粒pSET4E；步骤(2)所述的获得靶基因敲除质粒的方法是：设计引物用PCR方法分别扩增乳酸片球菌靶基因的上游和下游、大小约为1kb的同源片段，先后按一定方向克隆至pSET4E的多克隆位点，得到该靶基因的敲除质粒；步骤(3)将敲除质粒通过电转化进入乳酸片球菌DQ2得到含敲除质粒的菌株方法是：将1μg质粒(大约10μL)与80μL乳酸片球菌DQ2感受态细胞混合，在2000V、200Ω、25μF(1mm电击杯)条件下电击，电击后迅速将菌液转移到1mL的复苏液里冰置5min，后转移到28℃培养箱中培养2.5h，5000rpm离心4min，吸取800μL上清，剩下的混匀后涂布于含红霉素的MRS平板，28℃培养3d左右长出转化子，挑取阳性克隆进行PCR验证；步骤(4)所述发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的单交换子的验证方法是：将含敲除质粒的乳酸片球菌DQ2接种至添加红霉素的MRS培养基中28℃、150rpm条件下培养到对数期，以获得大量含敲除质粒的菌株，然后以1％的接种量将上述菌液接种到不含红霉素的MRS培养基中，42℃(在该温度下，质粒不能进行复制，筛选得到的对红霉素有抗性的菌株即为发生单交换的菌株)、150rpm条件下培养到稳定期，上述菌液稀释10⁶倍后涂布于含有红霉素的MRS平板上42℃培养，获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的单交换子，设计引物进行PCR验证；步骤(5)所述筛选发生第二次同源重组实现靶基因敲除的菌株的方法是：将单交换子接种到含红霉素的液体MRS培养基中42℃、150rpm培养至稳定期，以1％的接种量将上述菌液接种到MRS培养基中，28℃(在低温下激活整合到基因组上的质粒片段进行滚环复制，通过同源重组方式发生剪切)、150rpm条件下培养到稳定期，将培养液以1％的接种量接种到MRS培养基中，相同条件培养以获得第二次培养液，长到稳定期后同样接种到MRS培养基中进行培养，从而获得第三次的培养液，最多转接10次直至筛选到发生第二次同源重组实现靶基因敲除的菌株；将每次培养的菌液稀释10⁶倍后涂布MRS平板，42℃培养，用牙签挑取长出的单菌落，分别点种在含有红霉素和不含有红霉素的MRS平板上，42℃培养；对于在不含有红霉素的平板上可以生长而在含红霉素平板上不能生长的菌株，应该是发生双交换同源重组的菌株；设计引物进行PCR验证，从而得到靶基因敲除的突变株。