[发明专利]一种人胚胎干细胞定向分化为造血干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂及其制备方法，具体地说所述的干细胞制剂是一种由胚胎干细胞在体外诱导生成的造血干细胞制备而成，所述的干细胞制剂中至少包括（1‑5）×10⁶个源于胚胎干细胞的造血干细胞，一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂的制备方法包括如下步骤：（1）人胚胎干细胞的传代培养，（2）造血干细胞拟胚体的形成，（3）人胚胎干细胞向造血干细胞分化，（4）造血干细胞的培养和传代及检测，（5）干细胞制剂的制备。

主权项

1.一种人胚胎干细胞向造血干细胞分化的方法，主要包括以下步骤：胚胎干细胞的传代培养，造血细胞拟胚体的形成，人胚胎干细胞向造血干细胞分化，造血干细胞的培养和传代及检测；其中，（1）所述的胚胎干细胞的传代培养的步骤具体为：常规培养胚胎干细胞进行传代和扩增，此阶段培养基为：DMEM培养基为基础培养基，添加15%胎牛血清或血清替代品，1mmol/L必需氨基酸，50IU/mL青霉素，10μg/mL链霉素和4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子；（2）所述的造血细胞拟胚体的形成：在传代培养6‑7天对胚胎干细胞进行诱导，用1mg/mLⅣ型胶原酶吹打成小细胞团，然后使用超低黏附6孔培养板培养7天，每2天换液一次，在拟胚体形成阶段80%DMEM培养基为基础培养基，添加20%胎牛血清或血清替代品，1mmol/L必需氨基酸，50IU/mL青霉素，10μg/mL链霉素，在拟胚体EBs形成阶段的第5‑7天，在培养基中添加4种定量的制剂，分别是丝裂霉素，浓度为0.1mM；维生素C，浓度为1×10⁴mol/L；L‑谷氨酰胺，浓度为2mM；β‑巯基乙醇，浓度为0.1mM；（3）所述的人胚胎干细胞向造血干细胞分化的步骤具体为：拟胚体培养7天后，在显微镜下观察是否有红细胞出现，红细胞团用拉细的玻璃吸管机械切割并进行单细胞传代培养； （4）所述的造血干细胞的培养和传代及检测的步骤具体为：将上述成功诱导生成的造血干细胞消化、终止消化反应，进行传代培养，并进行流式细胞仪检测阳性标记物CD34达到99%以上，此阶段培养基为DMEM培养基为基础培养基，添加15%胎牛血清或血清替代品，1mmol/L必需氨基酸，50IU/mL青霉素，10ug/mL链霉素； 取生长良好的第三代细胞进行检测：收集第三代细胞，1500rpm离心10min，弃上清，加PBS溶液重悬，吸取100μL细胞悬液加入EP管内，按量分别加入检测抗体；避光孵育30min，每样品管加入2mlPBS洗一次，1500rpm离心5min；弃上清，每样品管加300μLPBS溶液重悬，进行流式检测。