[发明专利]一种分子伴侣共表达提高海藻糖合酶基因表达水平的方法

摘要

本发明公开了一种分子伴侣共表达提高海藻糖合酶基因表达水平的方法。本发明运用分子生物学技术在表达嗜热细菌海藻糖合酶的重组大肠杆菌中转化含有海藻糖合酶基因的pET‑22b‑tttreS质粒和含有sigma32、GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ单独地或随机组合的质粒，使海藻糖合酶和分子伴侣实现共表达。在三种分子伴侣联合使用的作用下，增加了外源蛋白可溶性表达量。本发明将海藻糖合酶和分子伴侣共表达，提高了海藻糖合酶的表达水平。

主权项

一种分子伴侣共表达提高海藻糖合酶基因表达水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)嗜热细菌(Thermus thermophilus)HB27海藻糖合酶基因编码区的克隆及其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达将嗜热细菌总DNA根据已知的海藻糖合酶基因编码区序列，设计一对上下游引物，设计的引物为：上游引物22tttreSNcoF：5’‑GGGAAACCATGGGTGGACCCCCTCTGGTACAAG‑3’,22tttreSSalR：5’‑GGGAAAGTCGACGGCTTTTCCGGCCTTGGC‑3’；PCR反应体系为50μL：嗜热细菌基因组模板DNA 1μL，上下游引物各2μL，dNTP Mix 3μL，2×PrimeSTAR GC Buffering 25μL，DMSO 0.75μL，ddH2O 15.65μL，PrimeSTAR 0.6μL；PCR反应条件为98℃预变性1min，进行98℃12s，65℃10s，72℃2min54s，共9个循环，然后进行98℃12s，57℃30s，72℃2min54s，共21个循环，最后72℃延伸3min；切胶回收PCR产物并将其克隆至pET‑22b上；对所获得的海藻糖合酶进行测序，构建pET‑22b‑tttreS质粒并实现其在大肠杆菌中的表达；(2)分子伴侣sigma32，GroeL，GroeS，DnaK和DnaJ基因的克隆及pCS27‑sigma32，pCS27‑GroeL‑GroeS，pCS27‑DnaK‑DnaJ，pCS27‑sigma32‑GroeL‑GroeS，pCS27‑sigma32‑DnaK‑DnaJ，pCS27‑GroeL‑GroeS‑DnaK‑DnaJ和pCS27‑sigma32‑GroeL‑GroeS‑DnaK‑DnaJ重组质粒的构建；(3)共表达分子伴侣sigma32、GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ诱导表达海藻糖合酶分别将pET‑22b‑tttreS和pCS27‑sigma32、pCS27‑GroeL‑GroeS、pCS27‑DnaK‑DnaJ、pCS27‑sigma32‑GroeL‑GroeS、pCS27‑sigma32‑DnaK‑DnaJ、pCS27‑GroeL‑GroeS‑DnaK‑DnaJ、pCS27‑sigma32‑GroeL‑GroeS‑DnaK‑DnaJ转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，诱导表达海藻糖合酶。