[发明专利]一种人巨细胞病毒活动性感染快速检测方法及用于该检测方法的试剂盒

摘要

本发明公开了一种人巨细胞病毒活动性感染快速检测方法及用于该检测方法的试剂盒。主要用于孕妇、新生儿和免疫功能低下人群，包括移植患者、艾滋病患者、肿瘤患者、糖尿病患者和年龄因素导致免疫功能下降的老年人的人巨细胞病毒活动性感染的快速监测及诊断。本发明同时也涉及使用该检测方法的试剂盒制备。

主权项

一种自制HCMV pp65单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、HCMV pp 65 DNA重组质粒的获取（1）根据Genebank中已公布的HCMV基因序列，确定HCMV pp 65基因编码序列，设计用于扩增HCMV pp 65的PCR引物，以HCMV AD169株RNA为模板，逆转录成cDNA,再通过PCR扩增出不含内含子的HCMV pp 65基因，将其克隆至 pcDNA3.0载体上，构建重组质粒pcDNA3.0‑pp65，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，通过DNA测序获得序列正确的pcDNA3.0‑pp65质粒；（2）将序列正确的pcDNA3.0‑pp65质粒转染至HEK 293细胞，24h 后Western blotting鉴定其是否能够在真核细胞中表达HCMV pp65蛋白，鉴别出能够在真核细胞中表达HCMV pp65蛋白的序列正确的pcDNA3.0‑pp65质粒；（3）将含有鉴别出的pcDNA3.0‑pp65质粒的菌种大量培养，收集菌体后通过碱裂解法裂解菌体，再依次经Sepharose 4 FF分子筛、Plasmid Select 亲和层析和SOURCE 30Q阴离子柱层析纯化，得到纯化后的pp65 DNA重组质粒；B、小鼠免疫将纯化后的pp65 DNA重组质粒与佐剂按3:1的比例混合，对小鼠进行多点肌肉注射；每隔2周免疫一次，共4次；最后一次免疫后1周，鼠尾采血通过琼脂双扩散试验检测抗体滴度，取抗体滴度大于1:8的小鼠，处死后无菌取出脾脏，研磨法获得免疫后的BALB/c小鼠脾的细胞；C、细胞融合取Sp2/0骨髓瘤细胞与免疫后的BALB/c小鼠脾细胞按1:10的比例混合均匀，1000rpm离心10min，弃上清，置37℃水浴预热，用1mL吸管在45s内加完预热至37℃的1mL浓度50%的PEG 1500，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入30 mL预热至37℃的1640不完全培养基，室温静置10min，1000rpm离心10min，弃上清，加入20mL含20%FCS和HAT的1640培养基重悬，分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5% CO2培养箱中培养，观察细胞的生长状况，4~6天后用含有20%FCS和HT的1640培养基继续培养，再次换液时仍用有20%FCS和HT的1640培养基继续培养，4~6后改用20%FCS的1640培养基培养， 等到细胞集落大于96孔板底部1/4面积时，取上清检测融合后杂交瘤细胞是否分泌抗pp65抗体；D、间接免疫荧光法检测培养上清中pp65单克隆抗体按5×104/孔接种MRC‑5细胞至96孔板中，培养过夜；次日按MOI=0.02接种HCMV AD169株病毒至96孔板各孔；培养72h后弃去培养基，用PBS洗涤细胞3次，每次3min，甩干；每孔加入100μL无水乙醇，室温作用15min；弃去乙醇，加入PBS洗涤3次，每次3min；向每孔加入待检杂交瘤培养上清50μL，4℃孵育过夜；加入PBS洗涤3次，每次3min；加入稀释好的山羊抗小鼠IgG‑FITC二抗，37℃孵育30min，加入PBS洗涤3次，每次3min；倒置荧光显微镜下观察，筛选免疫荧光染色阳性的杂交瘤；E、杂交瘤克隆化培养杂交瘤克隆化采用有限稀释法，最终获得2株产抗HCMV pp65蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞H0105和F0249；F、单克隆抗体的亚型用Mouse monoclonal antibody isotyping kit进行测试，结果显示H0105分泌的单克隆抗体亚型为IgG2b；F0249分泌的单克隆抗体亚型为IgG1，轻链均为κ链。