[发明专利]兔抗IgY抗体的制备方法、酶标记抗体的制备方法及应用

摘要

本发明提供了一种兔抗IgY抗体的制备方法、酶标记抗体的制备方法及应用，兔抗IgY抗体的制备方法包括如下步骤(1)硫酸铵盐析法粗提取IgG；(2)葡聚糖凝胶纯化IgG。该兔抗IgY抗体的制备方法为酶标记抗体IgG‑HRP的制备提供了基础，简单实用，容易推广，酶标记抗体IgG‑HRP能针对一个抗原的多个表位进行识别，可以提高检测的灵敏度，因此，酶标记抗体IgG‑HRP可以适用各种卵黄抗体鉴定、效价检测的通用试剂。

主权项

一种兔抗IgY抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)硫酸铵盐析法粗提取IgG：(101)取等体积量的兔抗IgY免疫血清和生理盐水进行混合，边搅拌边滴加饱和硫酸铵，使溶液中硫酸铵饱和度为50％，记录此时饱和硫酸铵的加入量X毫升，X＞0，4℃静置3h以上，3000rpm离心20min，弃上清液，得沉淀物；(102)沉淀物用生理盐水稀释至0.5X毫升，边搅拌边滴加饱和硫酸铵，使溶液中硫酸铵饱和度为33％，4℃静置3h以上，3000rpm离心20min，弃上清液，取沉淀物；重复此步骤2次；(103)按每毫克沉淀物加500ul的生理盐水的比例用生理盐水溶解步骤(102)所制得的沉淀物，装入透析袋，置4℃用0.1mol/L、PH值为7.4的磷酸盐缓冲液PBS作为透析处理液进行透析除盐，更换透析处理液数次直至：奈氏试剂测定无NH4+，1％BaCl2测定无SO42‑；得所需的IgG样品，置4℃保存；(2)葡聚糖凝胶纯化IgG：(201)凝胶的预处理；(202)装柱：凝胶床总体积与IgG样品的加入体积量应满足：IgG样品的加入体积量为凝胶床总体积的5％～10％；(203)加样：凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时，关闭流出口，用滴管加入样品，打开流出口，使样品缓慢渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面持平时，用洗脱液冲洗管壁；(204)洗脱与收集：连接好凝胶柱层析系统，调节洗脱液流速为每分钟1毫升，进行洗脱，收集洗脱液中与目的峰相应的部分洗脱液作为所需的兔抗IgY抗体；其中，所述步骤(101)中兔抗IgY免疫血清的制备方法，包括以下步骤：(111)IgY制备：取鸡蛋卵黄并加入8倍体积的灭菌的双蒸水，用浓度为0.1M的HCl溶液调PH为5.0‑5.1，置4℃搅拌8h，得卵黄稀释液；取卵黄稀释液，以10000‑12000rpm、4℃进行离心15min，收取上清液；于上清液中加入使用0.01mol/L、PH7.4的PBS液配制的浓度为8％的PEG6000，其中，鸡蛋卵黄量/浓度为8％的PEG6000量＝5g/ml，搅拌30min，以10000‑12000rpm、4℃进行离心10min，收集沉淀，去上清液；将沉淀物溶于0.01mol/L、pH7.4的PBS液并装入透析袋中，每毫克沉淀物对应500μl的PBS液；在0.01mol/L、PH值为7.4的PBS透析液中透析，每毫克沉淀物对应500ml的透析液；透析完成后用0.22μm膜过滤除菌，取蛋白质浓度大于30mg蛋白/ml的产物作为所需的IgY，置‑20℃保存；(112)IgY免疫原制备：将所制备的IgY用PBS液进行稀释至蛋白质浓度30mg蛋白/ml，将10ml弗氏完全佐剂置于研钵内，边研磨边滴加等量稀释后的IgY，直至形成白色油包水乳剂，置4℃保存备用；(113)免疫家兔：选用2～2.5kg健康家兔，于颈后，两后肢大腿外侧共四个部位皮下各注射步骤(112)所得物0.5ml，7天后再次同样免疫，21天后同样部位注射步骤(111)所得物0.5ml，末次注射后第7天试血，双向琼脂扩散试验效价达1∶16～1∶32放血收集血清，得兔抗IgY免疫血清。