[发明专利]一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的跨膜型胞内抗体、制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的跨膜型胞内抗体、制备方法及其应用。本发明通过将扩增的鸡源抗NDV的P蛋白单链抗体scFv ZL1编码基因与跨膜肽CTP基因融合，得到scFvZL1‑CTP编码基因，将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中，构建鸡源性抗NDV的P蛋白的跨模型细胞内抗体表达质粒(pET28a‑scFvZL1‑CTP)；其原核表达产物就是跨模型胞内抗体(Trans‑ZL1‑CTP)。将跨模型胞内抗体转染BHK21细胞，其能够在宿主细胞内胞浆内均匀分布，对细胞没有毒性作用；TCID50法检测证明，跨模型胞内抗体对细胞有一定的保护效果，可以用于鸡新城疫的治疗。

主权项

一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的跨膜型胞内抗体的制备方法，其将扩增的鸡源抗NDV的P蛋白单链抗体scFv ZL1编码基因与跨膜肽CTP基因融合，得到scFvZL1‑CTP编码基因，再将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中，构建鸡源性抗NDV的P蛋白的跨模型细胞内抗体表达质粒pET28a‑scFvZL1‑CTP；其原核表达产物就是跨模型胞内抗体Trans‑ZL1‑CTP，其特征在于：具体步骤如下：(1)PCR扩增目的基因取冷冻保存的抗体ZL1工程菌，分区划线LB平板，从LB平板挑取单克隆后摇菌，按常规方法提取质粒，取1μl作为模板，利用特异性引物PCR扩增目的基因scFvZL1‑CTP，所述特异性引物中融合加入33个碱基的CTP；经检测无误后，采用AxyGEN胶回收试剂盒回收扩增的目的片段scfvZL1‑CTP；(2)目的片段scFvZL1‑CTP和原核表达载体pET28a(+)载体黏性末端的制备将上述回收的目的片段scFvZL1‑CTP和原核表达载体pET28a(+)用EcoR I和Nco I双酶切，然后经琼脂糖凝胶电泳验证，对酶切产物目的条带，采用AxyGEN胶回收试剂盒回收；(3)目的基因与表达载体的连接将上述回收的目的片段scFvZL1‑CTP和原核表达载体pET28a(+)载体用T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pET28a‑scFvZL1‑CTP；(4)pET28a–scFvZL1‑CTP重组质粒诱导表达和纯化先将重组质粒pET28a‑scFvZL1‑CTP转化至Trans1‑Blue感受态细胞中，重组菌经1mM的IPTG诱导表达后，收集菌体，得到跨膜型细胞内抗体表达质粒pET28a–scFvZL1‑CTP；再用冰浴PBS悬浮细菌，加入2×SDS‑PAGE上样缓冲液，煮沸，然后放入冰水混合物冷冻、离心收集沉淀；最后采用Ni‑NTA‑琼脂糖纯化柱纯化沉淀，得到纯化后的原核表达产物，即跨膜胞内抗体Trans‑ZL1‑CTP。