[发明专利]重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用有效
| 申请号： | 201510021863.1 | 申请日： | 2015-01-15 |
| 公开（公告）号： | CN104611368B | 公开（公告）日： | 2018-05-25 |
| 发明（设计）人： | 陈永龙;石照应 | 申请（专利权）人： | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;A01K67/033 |
| 代理公司： | 广州三环专利商标代理有限公司 44202 | 代理人： | 郝传鑫;熊永强 |
| 地址： | 510000 广东省*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明提供了一种重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用。该方法包含以下步骤:1)使爪蛙受精卵中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及带有胰腺ela‑荧光筛选标签和Cas9靶标片段的供体载体，2)在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，爪蛙基因组中目的基因中以及供体载体上的双链Cas9靶标片段被剪切，3)通过爪蛙细胞的自身DNA修复功能，实现在爪蛙基因组中的基因定点敲入；4)G0代胚胎通过胰腺ela‑荧光标签进行筛选，并对F1进行southern blot鉴定。本发明为利用爪蛙为模式动物研究遗传学和研究人类疾病奠定基础。 | ||
| 搜索关键词： | 爪蛙 基因组 基因定点 靶标片段 供体载体 移码突变 核酸酶 胰腺 模式动物 目的基因 人类疾病 荧光标签 荧光筛选 受精卵 被剪切 遗传学 双链 应用 胚胎 标签 筛选 细胞 研究 | ||
【主权项】：
1.一种在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，是利用CRISPR/Cas系统在爪蛙中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，其特征在于，所述方法包含以下步骤:1)使爪蛙受精卵中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及供体载体，2)然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，爪蛙基因组中目的基因中以及供体载体上的双链Cas9靶标片段被剪切，3)再通过爪蛙细胞的自身DNA修复功能，实现在爪蛙基因组中的基因定点敲入；其中，所述向导RNA包括与所述Cas9靶标片段互补结合的RNA片段；所述供体载体包括Cas9靶标片段和待敲入的基因；所述爪蛙基因组中的目的基因包括Cas9靶标片段；所述向导RNA中，与所述靶标片段互补结合的RNA片段为如SEQUENCE NO.2、SEQUENCENO.3或SEQUENCE NO.4所示DNA转录出来的；所述步骤(1)中，所述供体载体还包括爪蛙基因组的内含子序列和外显子序列，所述供体载体中，所述Cas9靶标片段位于所述内含子序列中，所述内含子序列、外显子序列和待敲入基因依次连接；所述内含子序列和外显子序列总长度为如SEQUENCE NO.9、SEQUENCE NO.10或SEQUENCE NO.11所示的核苷酸序列。
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