[发明专利]一种利用家蚕生物反应器生产普兰林肽(PA)的方法

摘要

本文发明公开了一种表达普兰林肽的方法，属于基因工程的技术领域。其特征在于：利用杆状病毒多基因表达系统，细菌感染家蚕卵巢细胞，产生一种能同时表达人源酰胺化酶与普兰林肽的杆状病毒，然后将病毒注射入五龄起家蚕体内，使家蚕共同表达出酰胺化酶与普兰林肽，其中，普兰林肽C端的甘氨酸直接被酰胺化酶酰胺化，从而生产出具有活性的普兰林肽，通过常规纯化手段纯化出普兰林肽。采用本发明的方法，能表达多个基因，利于共同表达人源酰胺化酶与普兰林肽；本发明利用家蚕生物反应器，蛋白表达量高，修饰更为完善；本发明工艺生产时间短，效率高，生产成本低。

主权项

一种生产普兰林肽的方法，所述方法包括下述步骤：(1)获得SEQ ID No.1所示的人源酰胺化酶基因，并连接至转移载体pFBDM(购自深圳市宝珠生物科技有限公司，货号zt323)中构建重组质粒pFBDM‑PAM；(2)向步骤(1)构建的重组质粒pFBDM‑PAM中插入IRES(序列如SEQ ID No.3所示)和mCherry(序列如SEQ ID No.4所示)，得到重组质粒pFBDM‑PAM‑IM；(3)获得SEQ ID No.2所示普兰林肽基因，并连接至转移载体pUCDM(Sun，Jingchen，et al，A High Efficient Method of Constructing Recombinant Bombyx mori(Silkworm)Multiple Nucleopolyhedrovirus Based on Zero‑Background Tn7‑Mediated Transposition in Escherichia coli，Biotechnol.Prog.，2009，Vol.25，No.2，pp524‑529)，获得重组质粒pUCDM‑PA；(4)向步骤(3)构建的重组质粒pUCDM‑PA中插入IRES和GFP(序列如SEQ ID No.5所示)，得到重组质粒pUCDM‑PA‑IG；(5)将步骤(2)构建的重组质粒pFBDM‑PAM‑IM和步骤(4)构建的重组质粒pUCDM‑PA‑IG通过转座的方式导入asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106感受态细胞，构建能表达人源酰胺化酶与普兰林肽的重组基因病毒DNA的重组大肠杆菌SW106细胞(本实验室按照常规方法改造，改造方法参见Sun，Jingchen et al，Biotechnol.Appl.Biochem.(2010)，57，117‑125(Printed in Great Britain)doi：10.1042/BA20100148)；(6)将步骤(5)制备的重组大肠杆菌SW106细胞在Grace培养基(购自Gibco)中直接感染昆虫细胞BmN(ATCC CRL‑8910)产生杆状病毒，再利用所述杆状病毒上清液感染5龄家蚕幼虫(饲养环境为28℃，湿度60％至70％之间，每天给予足够的桑叶以及每天及时清除蚕粪)，进行重组蛋白的表达；(7)收集感染的昆虫幼虫淋巴液，镍柱亲和纯化得到所述普兰林肽，并进行测活。