[发明专利]一种水稻广亲和隐性核不育系的鉴定与利用方法

摘要

本发明属于作物分子育种领域，涉及一种水稻广亲和隐性核不育系的鉴定与利用方法。利用籼稻“特青”和广亲和品种“02428”构建重组自交系，筛选育性特征的自交系，培育筛选新的不育系RI127S，该不育系可用于水稻轮回育种的中间材料。优点是：1)雄性不育系的不育性为隐性基因控制，其不育性在正常生长条件下不受光长和温度影响，是水稻理想轮回选择中间材料。2)不育系RI127S不仅带有广亲和基因，而且其基因组是籼稻和粳稻品种的混合体，与籼、粳稻杂交，杂种均为可育，F1结实率籼稻为85％，粳稻为80％；3)自交系RI127本身具有高产性能，可做优良品种的亲本，作不育系可省去人工去雄杂交工序。

主权项

1.一种利用水稻广亲和隐性核不育系培育新品种的方法，其特征在于下列步骤：(1)将籼稻与粳稻杂交，杂交种都可育的广亲和品种02428与籼稻品种特青杂交，通过自交一代获得F2代，通过单粒传法构建重组自交系，在F6代的第127家系出现育性分离，筛选得到不育系RI127S，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：P201415；(2)以所得的不育单株RI127S作母本，以水稻籼稻品种明恢63作父本，杂交得到F1代，利用F1自交一代得到育性分离的F2群体，提取F2群体单株总DNA，取10株可育单株的总DNA等量混合作为可育池模板，取10株不育单株的总DNA等量混合作为不育池模板，利用Gramene网站上报道的SSR标记中第一染色体上10对SSR标记作为引物，引物编号为RM1，RM151，RM158，RM580，RM23，RM129，RM237，RM319，RM315，RM165，进行PCR，将所得的扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶检测，筛选得到多态性标记；以获得的多态性标记引物RM580为引物，以F2群体全部单株为模板进行PCR，将所得产物利用聚丙烯酰胺凝胶检测，结合单株表型，将控制RI127不育系育性性状的基因定位于水稻1号染色体5.5Mb‑5.9Mb区段内；对5.5Mb‑5.9Mb区段内育性候选基因OsMADS3进行测序，以所述的可育池总DNA和所述的不育池总DNA为模板，利用粳稻品种日本晴中基因组OsMADS3的序列作为参考序列设计引物，编号为CAD6至CAD16F和R，MPF1，MP F2和R2，MPF3和R3，这些引物的序列见说明书表3所示，进行PCR，对PCR产物进行测序；以粳稻品种日本晴OsMADS3基因的CDS序列为参考序列设计引物，引物编号为M‑126F，M‑316R，3C‑1R，这些引物的序列见说明书表4所示，提取可育单株和不育单株的总RNA，反转录成cDNA作为模板，进行RT‑PCR，分析OsMADS3基因功能，确定控制RI127不育系的育性性状的基因为OsMADS3基因；(3)根据步骤(2)测序结果在不育单株和可育单株中OsMADS3基因上有差异的位置上设计相邻的三条引物SP1、SP2、SP3，利用步骤(2)所述的不育池模板，第一轮以SP1为侧引物，与随机引物AD2a进行组合，以不育池模板作为第一轮PCR的模板，进行PCR；将所得的PCR产物作为第二轮PCR的模板，以SP2为侧引物，用第一轮随机引物AD2a组合进行PCR；以第二轮的PCR产物为第三轮PCR的模板，以SP3侧引物，用第一轮随机引物AD2a组合进行PCR，利用最后一轮的所得PCR产物选取大于200bp的产物进行测序，找出在不育单株OsMADS3基因的第二外显子282bp处的插入序列，该插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；(4)提取RI127S不育系苗期单株叶片的总DNA，根据步SEQ ID NO：1所示序列设计引物InsertF1和1639R1，根据插入序列插在不育单株OsMADS3基因的位置，在插入位点两侧以粳稻品种日本晴中OsMADS3基因序列设计引物M‑361F和M‑820R，分别进行PCR扩增，根据出现条带鉴定RI127S不育系的基因型，当出现由引物M‑361F和M‑820R PCR扩增所得的产物为208bp的条带判定为野生可育基因型，当出现由引物InsertF1和1639R1 PCR扩增所得产物为1.7kb条带判定为不育基因型，当出现上述两对引物都能扩增出的条带判定为杂合可育型；(5)将带有鉴定为隐性雄性核不育基因的不育系作为轮回选择的中间材料，进行新品种，培育，具体步骤如下：1)将鉴定为性状优良的育种亲本材料分别编号1、2、3、4，将亲本材料1与2杂交得到F_1A，将亲本材料3与4杂交得到F_1B；2)以步骤1)中得到的F_1A和F_1B分别作父本，以RI127S不育系作母本进行杂交，其中F_1A和RI127S不育系杂交得到F_1C，通过自交一代得到F_2C；F_1B与RI127不育系杂交得到F_1D，通过自交一代得到得到F_2D；3)以F_2C中的不育单株作母本，以F_1B为父本杂交得到F₁，将F₁自交一代得到F₂，测验F₂的育性，得到杂合株系，对杂合株系自交后代进行筛选，得到株高、花期适中的杂合株系，对杂合株系自交3‑4代得到性能稳定的品种；4)以F_2D中的不育单株作母本，以F_1A为父本杂交得到到F₁，将F₁自交一代得到F₂，测验F₂的育性，得到杂合株系，对杂合株系自交后代进行筛选，得到株高、花期适中的杂合株系，对杂合株系自交3‑4代得到性能稳定的品种；其中,步骤(2)中所述的引物的DNA序列如下所示：RM1    GCGAAAACACAATGCAAAAA；GCGTTGGTTGGACCTGAC，RM151  GGCTGCTCATCAGCTGCATGCG；TCGGCAGTGGTAGAGTTTGATCTGC，RM158  ATGGTGAGAGTTGCTGCCGCCG；GATGACGCAGAACGGCATCGCC，RM580  GATGAACTCGAATTTGCATCC；CACTCCCATGTTTGGCTCC，RM23   CATTGGAGTGGAGGCTGG；GTCAGGCTTCTGCCATTCTC，RM129  TCTCTCCGGAGCCAAGGCGAGG；CGAGCCACGACGCGATGTACCC，RM237  CAAATCCCGACTGCTGTCC；TGGGAAGAGAGCACTACAGC，RM319  ATCAAGGTACCTAGACCACCAC；TCCTGGTGCAGCTATGTCTG，RM315  GAGGTACTTCCTCCGTTTCAC；AGTCAGCTCACTGTGCAGTG，RM165  CCGAACGCCTAGAAGCGCGTCC；CGGCGAGGTTTGCTAATGGCGG，步骤(3)中所述的引物的DNA序列如下所示：SP1   ACTAGTTAGCATACCCATCC，SP2   ATCTTGGTTGCCATGTTGTGAG，SP3   ATCGAGATAAAGCGGATCGAG，AD2a  5’NGTCGASWGANAWGAA3’，该AD2a引物中的N代表该碱基为A/G/C/T混合物，S代表碱基G/C混合物，W代表碱基A/T混合物，步骤(4)中所述的引物的DNA序列如下所示：InsertF1  TCTACGAGTACGCCAAC，1639R1    ATCCTTACTAGAATCGCAGC，M‑361F    ATCGAGATAAAGCGGATCGAG，M‑820R    AGCATAAGTAGGATGAGATGAG。