[发明专利]一种从混合物中垂钓筛选活性成分单体或活性成分组的方法

摘要

本发明属药物分析技术领域，涉及一种从混合物中垂钓筛选活性成分单体或活性成分组的方法。本发明结合高分辨串联质谱技术HRMS和表面等离子体共振技术SPR从混合化合物群中垂钓筛选基于靶蛋白的小分子活性单体或活性成分组，包括混合化合物群的HRMS分离分析，与疾病相关的受体蛋白、酶的芯片偶联，小分子活性单体或活性成分组的SPR靶向垂钓，活性成分缺失后混合化合物群的HRMS分离分析，基于各峰值变化的蛋白结合排序评价以及高活性成分单体或活性成分组结构鉴定等；本方法简单有效，可从混合先导化合物中快速初筛有效成分，和从植物提取物中先期垂钓筛选基于靶蛋白的未知活性成分单体或成分组，为进一步分离提取和鉴定提供高度的指向性。

主权项

1.一种从混合物中垂钓筛选活性成分单体或活性成分组的方法，其特征在于，结合HRMS 和 SPR 分析技术从小分子混合化合物群中垂钓筛选出基于靶蛋白的活性成分单体或活性成分组，包括：小分子混合化合物群提取液导入 UPLC/QTOF 系统进行指纹图谱分离分析，获得各成分峰的色谱或质谱响应值；与疾病相关的受体蛋白的芯片偶联；小分子混合化合物群导入 Biacore/SPR 系统进行靶向蛋白活性成分垂钓；活性组份缺失后回收液导入 UPLC/QTOF 系统进行指纹图谱分离分析，获得各成分峰的色谱或质谱响应值；根据各峰值变化，进行各个成分的蛋白结合排序评价，对高活性成分单体或活性成分组结构鉴定；所述方法包括步骤：1)建立 HRMS‑SPR 分析技术联用方法，制备靶蛋白的偶联和样品：靶蛋白为血清淀粉样蛋白A SAA，通过氨基偶联法将其固定在CM5传感芯片的四个通道上，每个通道的偶联量达到8000RU，则四个通道都偶联该靶蛋白，各标准品用无水乙醇或二甲基亚砜配制为1mg/ml的储备液，用缓冲液稀释，使样品中乙醇或二甲基亚砜的浓度低于5%；制备四种标准品咖啡酸、赤霉酸、白皮杉醇和根皮素的混合样：混合物中各标准品的浓度为12.5μg/ml；制备八种标准品豆香酸、根皮苷、金丝桃苷、异鼠李素‑O‑糖苷、芦丁、白藜芦醇、虎杖苷和白皮杉醇混合样：混合物中各标准品的浓度为6.25μg/ml；样品进样：当工作液以20‑30μl/min的速度流经芯片表面时，芯片表面物质的质量发生改变，仪器记录下对应的响应值变化，进样结束后，切换缓冲液流过芯片表面，与靶蛋白结合的成分自发分解，解离进程由响应值实时监控；样品回收：执行“Inject and recover”步骤 ：以50mM 的NH₄HCO₃为 deposition solution，0.5％ TFA 为洗液和回收液，一个回收循环中重复收集10 次，孵育时间30秒，回收时间28秒 ；对于和靶蛋白特异性结合后快速解离的成分，随缓冲液流进废液中，无法按照“ControlSoftware”软件中已编辑好的方法进行垂钓，需要先通过调整样品管放置即改变进样顺序，回收到与靶蛋白不结合或非特异结合的化合物，然后用高分辨质谱检测并数据分析，得出相对含量低的成分即为与蛋白特异性结合的成分，即垂钓所得的成分 ；调整方法为，“sample”位置放“running buffer”， “regeneration”位置放“sample”，在传感图上对应的“incubation start”表示进样开始，recovered 的样品是从 incubation 开始到结束而没特异性结合在芯片上的成分；建立快速液相串联高分辨质谱分析：取制备靶蛋白的偶联和样品步骤中配制的标准品混合样溶液和垂钓后的回收液，涡旋均匀后进行UPLC/DAD/QTOF分析；2)验证 HRMS‑SPR 分析技术联用，采用Biacore/SPR分析步骤1)标准品的混合物，对步骤1)标准品的混合物中单个成分的动力学参数，评价其活性，其一致性结果验证联合分析技术对混合成分评价方式的可行性和正确性；其中：采用 Biacore/SPR 分析白皮杉醇、咖啡酸、根皮素、赤霉酸、对豆香酸、根皮苷、金丝桃苷、异鼠李素‑O‑糖苷、芦丁、白藜芦醇、虎杖苷单个成分的动力学参数，评价其活性，其一致性结果验证联合分析技术对混合成分评价方式的可行性和正确性；3)HRMS‑SPR 分析技术联用方法用于垂钓筛选混合化合物群的活性成分及分析鉴定，以SAA和β‑淀粉样蛋白为靶标蛋白，从法国罗曼尼红葡萄酒中垂钓筛选基于 SAA 的活性成分及分析鉴定 ；或从银杏叶口服液中垂钓筛选基于β‑淀粉样蛋白的活性成分及分析鉴定。