[发明专利]一种用于敲除L-乳酸脱氢酶1基因的载体及构建方法

摘要

本发明公开了一种用于敲除L-乳酸脱氢酶1基因的载体及构建方法，该方法为将不含L-乳酸脱氢酶编码基因的该基因的上下游DNA片段利用重叠延伸法完成拼接并将此拼接片段克隆到亚载体pMD18-T上，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过蓝白斑筛选构建好的亚克隆载体，双酶切得到目的条带后连接到pG+host9质粒上，经过菌落PCR以及双酶切鉴定成功得到重组载体。本发明通过重叠延伸PCR的方法来构建敲除L-乳酸脱氢酶编码基因的重组质粒，避免了酶切连接引入多余的碱基序列。本发明重组载体可用于生产高光学纯度的D-乳酸。

主权项

一种用于敲除L‑乳酸脱氢酶1基因的载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从NCBI中找到L‑乳酸脱氢酶1编码基因的位置及其上下游800～1000bp的DNA序列，然后确定保守序列设计引物并引入重叠片段，提取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMDL 9010的DNA，并以此为模板，扩增得到不含L‑乳酸脱氢酶编码基因的该基因的上下游DNA片段，利用高保真酶进行重叠延伸PCR连接该基因的上下游DNA片段；所述植物乳杆菌DMDL的保藏编号为CGMCC NO.5172；(2)将上述连接片段的3′端进行加A反应后与pMD18‑T载体进行连接反应并转化到大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，最后得到亚克隆载体，然后大量制备亚克隆载体，进行XhoⅠ和PstⅠ双酶切，在重叠片段上引入粘性末端；(3)将经过XhoⅠ和PstⅠ双酶切处理的pG+host9质粒与步骤(2)制得的重叠片段进行连接反应，然后将此连接产物化转到大肠杆菌MC1061或TG1中，于红霉素抗性平板上进筛选阳性转化菌，得到重组载体。