[发明专利]环状小RNA文库构建方法及其应用

摘要

本发明提供了一种单链环状小RNA文库构建的方法，具体地涉及单链环状小RNA文库构建，所述单链环状小RNA文库还可用cPAL测序平台进行测序。本发明具有测序通量高，准确度高和操作简便的优点。

主权项

1.一种单链环状小RNA文库的构建方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供分离的总RNA样本；(b)对所述的总RNA样本进行纯化处理，从而获得纯化的总RNA；(c)在所述的纯化的总RNA的3’端连接带有条形码(barcode)的3’接头，从而获得3’端带有条形码(barcode)的3’接头的总RNA；(d)将上述步骤(c)中获得的所述的3’端带有条形码(barcode)的3’接头的总RNA，与反转录引物在3’接头区域进行退火，从而获得退火产物；(e)对上一步骤(d)获得的所述退火产物进行5’接头连接，从而获得带有5’接头的所述退火产物；(f)对上一步骤(e)中获得的带有5’接头的所述退火产物进行反转录，从而获得两端带有接头的cDNA；(g)对上一步骤(f)中获得的cDNA产物进行PCR扩增，从而获得DNA扩增产物；(h)对上一步骤中得到的所述DNA扩增产物，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并回收85‑97bp小RNA的扩增产物，获得纯化的DNA片段；(i)将上一步骤中获得的纯化DNA片段，与标记有亲和素的磁珠通过“亲和素‑生物素”进行结合，并碱性溶液进行处理，使没有生物素标记的那条链从磁珠上分离下来，再用酸溶液进行中和，从而获得两端带有接头序列的单链DNA溶液；(j)在上一步骤中得到的所述的两端带有接头序列的单链DNA溶液中，加入与两端接头序列匹配的桥式DNA引物和连接酶，进行单链环化反应，从而获得含有单链环化分子的混合物；(k)对上一步骤中所述的含单链环化分子的混合物，用特异性线性核酸酶消化掉未环化的单链DNA以及桥式DNA引物；从而获得含有未消化的单链环化产物的混合物；(l)对上一步骤中的所述含有未消化的单链环化产物的混合物进行纯化定量，分离出所述的环化产物，从而获得小RNA测序单链环状DNA文库。