[发明专利]一种真菌α‑淀粉酶基因工程菌及其构建方法

摘要

本发明公开了一种真菌α‑淀粉酶基因工程菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明所提供的基因工程菌是利用黑曲霉α‑淀粉酶基因amyA置换出发菌株的糖化酶基因glaA获得的基因工程菌。本发明所提供的基因工程菌在液态发酵条件下，高产高纯度真菌α‑淀粉酶，发酵液中真菌α‑淀粉酶活性达到15368U/mL，真菌α‑淀粉酶含量占分泌蛋白总量的90％以上，发酵液中糖化酶，蛋白酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶等活性极低。同时，本发明还提供了该基因工程菌的构建方法。

主权项

一种适合液态发酵的真菌α‑淀粉酶基因工程菌，其特征在于，是利用黑曲霉α‑淀粉酶基因amyA置换出发菌株的糖化酶基因glaA获得的基因工程菌；上述基因工程菌的具体步骤如下：1)以黑曲霉CICC2462基因组DNA为模板，设计并合成引物扩增黑曲霉α‑淀粉酶基因amyA，再将扩增产物与克隆载体pMD18‑T连接后，获得质粒载体pMD‑amyA；所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；2)利用ApaI、HindIII酶对步骤1）所得的质粒载体pMD‑amyA进行双酶切后回收目的片段，再与同样经过双酶切的载体pSZHG的目的片段进行连接，获得黑曲霉同源重组表达载体pSZHG‑amyA；3)采用冻融法将步骤2）所得的黑曲霉同源重组表达载体pSZHG‑amyA转化入农杆菌AGLI中，将转化后的农杆菌AGLI接种到YEB培养基上培养后，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，检测黑曲霉同源重组表达载体pSZHG‑amyA，农杆菌AGLI介导法转化黑曲霉CICC2462，转入成功即获得黑曲霉同源重组转化子；4)利用潮霉素对步骤3）所得的黑曲霉同源重组转化子进行筛选，获得糖化酶基因位点整合的不含有筛选标记基因HPH的转化子，再利用同源重组引物对转化子进行PCR检测，能扩增出1701bp目的条带的即为同源重组转化子，再将含有同源重组转化子的菌株在含有200mg/L的潮霉素B的PDA液体培养基中连续传代培养，28℃下培养3‑4d后，获得纯合同源重组菌株，即真菌α‑淀粉酶基因工程菌；所述同源重组引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。