[发明专利]一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移酶COMT活性的方法

摘要

一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移酶COMT活性的方法，属于毛细管电泳检测技术及儿茶酚氧甲基转移酶检测技术领域。本发明所建立的方法分析慢性应激诱导氧化性损伤抑郁症大鼠以及叶酸和不同剂量PQQ腹腔注射后脑组织COMT活性的变化，未见文献报道，为抑郁症的发病机制和药物作用靶点提供新的依据。本发明所采用的毛细管电泳法分析速度更高，分离度更好，能快速检测脑组织中COMT活性浓度，与以往检测COMT的方法相比具有明显优势，不需要衍生化，与文献方法相比，本方法具有更好的可靠性和选择性，而且具有灵敏度高、分析速度快等特点。

主权项

一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移酶COMT活性的方法，其特征在于步骤为：（1）毛细管选择及预处理：选用未涂层的45cm×50µm石英毛细管柱；新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，1M NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗15min；进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲洗2min；运行缓冲液为：200mmol/L PBS体积百分60%+75 mmol/L硼酸体积百分40%的缓冲体系，pH=10，缓冲体系含体积百分0.05%三氟乙酸；（2）毛细管电泳分析条件：检测波长为350nm，进样方式为0.5psi压力进样，进样时间10.0s，分离电压为25kV，毛细管柱温25℃；（3）标准曲线的建立：标准溶液的配制：精密称取对照品3,4‑二羟基苯甲酸0.005g，溶于5mL 50mM PBS缓冲液配成1mg/mL的储备液，用该缓冲液稀释成25、50、100、150、200μg/mL的3,4‑二羟基苯甲酸标准溶液进样，每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归，结果在25‑200μg/mL的范围内线性关系良好，回归方程为Y=166111x+11747，相关系数r2=0.9951，在25～200μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系，最低检出浓度为0.02~0.5μM，S/N≥3；（4）脑组织COMT酶活性测定（4.1）样品的制备：脑组织处理：脑组织精密称重，加入组织裂解液，脑组织重量:组织裂解液=1g:7.5mL，匀浆，4℃14000g离心15min，取上清液A；上清液A再14000g离心15min，取二次离心后上清液B，上清液B于‑80℃冰箱保留；组织裂解液为含0.6M 高氯酸PCA和0.5mM EDTA二钠，即16.6mL PCA和0.092g EDTA二钠溶于500mL水配制而成；测试前先低温解冻上清液B，再加入等体积的含1.2M K2HPO4和2mM EDTA二钠的溶液，称为PCA沉淀剂，用于沉淀反应剩余的PCA，冰浴中放置10min后4℃14000g离心15min，取上清液C，即COMT酶液；之后进行酶反应体系孵育；（4.2）酶反应体系制备：2mM氯化镁100μL +0.2mM S‑腺苷甲硫氨酸100μL+0.2mM 3,4‑二羟基苯甲酸150μL+最后离心出来的上清液C 150μL，反应体系总体积为500μL，漩涡振荡后于37℃孵育60min；之后加入80μL冰冷2M PCA终止反应，16000g离心15min为上清液D，取上清液D为待测物；按步骤（1）所述毛细管电泳分析条件进样，所得峰面积代入标准曲线回归方程计算得到反应剩余3,4‑二羟基苯甲酸的浓度，计算单位时间内转化为3‑羟基4‑甲氧基‑苯甲酸，即为COMT活性：XCOMT活性=()×1000，μM/g.min，C0为3,4‑二羟基苯甲酸起始浓度，C为反应剩余3,4‑二羟基苯甲酸浓度，tmin为反应孵育时间min，G为脑组织重量g。