[发明专利]一种重组鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体的纯化及高效复性液对其复性的方法

摘要

本发明属于蛋白纯化的技术领域，涉及的是生物医药及生物工程下游蛋白纯化领域，本发明公开了一种重组鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体的纯化及高效复性液对其复性的方法。本发明的包涵体蛋白的三步洗涤纯化工艺方法，使菌体蛋白与包涵体得到很好的分离，再通过复性溶液及点滴加样一次复性的工艺方法，使蛋白质的复性率大大提高，同时简化复性工艺及所需设备，从而大大提高目的蛋白的收获率，降低重组鸡大肠杆菌外膜蛋白的生产成本。该重组鸡大肠杆菌外膜蛋白纯化方法简便易行，无需进行过柱处理。

主权项

一种重组鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体的纯化及高效复性液对其复性的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)包涵体蛋白的提取：4℃，4000～6000rpm，10～20min，离心收集菌体，PBS洗涤菌体，4℃，6000～8000rpm，10～20min，将菌体超声破碎，功率400瓦，超声5秒,间歇25秒，工作时间20～35分钟，所述菌体为重组鸡大肠杆菌；然后4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷冻离心得到鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体蛋白质；(2)包涵体蛋白质的纯化：首先按质量体积比1：10～1：30将包涵体重悬于第一洗涤液中，所述洗涤液为：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄ 2mmol/L，0.2％～1.4％的tritonX‑100，pH 8.0～8.5；4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷冻离心；然后按质量体积比1：10～1：30将包涵体重悬于第二洗涤液种，所述第二洗涤液为：1～3mol/L尿素；4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷冻离心；接着按质量体积比1：20～1：50将包涵体重悬于第三洗涤液中，所述第三洗涤液为：0.6～2mol/L NaCl，4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷冻离心；最后按质量体积比1：30～1：50将包涵体重悬于0.5～2％十二烷基硫酸钠，4℃，8000～10000rpm，20～30min高速冷冻离心，收集沉淀；(3)包涵体蛋白质的溶解与复性，按质量体积比为1：10～1：40将步骤(2)得到的沉淀用变性剂重悬，所述变性剂为：5～7mol/L盐酸胍，1～2mmol/L EDTA，20～50mmol/L Tris‑Base，6～10mmol/L二硫苏糖醇，pH 8.0～8.5；室温放置至沉淀逐渐溶解；4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷冻离心，收集上清液；4℃条件下，使变性液逐滴加入复性缓冲液中，所述复性缓冲液为：0.2～0.8mol/L精氨酸，0.5～2mmol/L EDTA，0.3～0.9mmol/L氧化型谷胱甘肽，60～100mmol/L Tris‑Base，15～30％甘油，pH 8.0～8.5，同时搅拌24～48h。