[发明专利]一种白背三七细胞悬浮培养体系的构建方法

摘要

本发明公开了一种白背三七细胞悬浮培养体系的构建方法，涉及白背三七（Gynura divaricata(L.)DC.）通过植物细胞离体培养技术手段积累并生产有效成分的方法。本发明以白背三七幼叶为外植体，通过白背三七愈伤组织诱导、胚性愈伤筛选及增殖等步骤建立了白背三七细胞悬浮培养体系，为通过组织培养技术脱除白背三七吡咯里西啶生物碱（HPAs）并积累有效成分提供技术支持。

主权项

一种白背三七细胞悬浮培养体系的构建方法，其特征在于包括以下工艺步骤：（1）外植体消毒：选取白背三七嫩叶用清水洗净，在工作台中用2%～5%的洗洁精溶液漂洗1～5min，无菌水冲洗3～5次后用75%～80%乙醇溶液浸泡10～30s，0.1%～0.2%升汞溶液消毒5～10min，2%～4%次氯酸钠溶液消毒10～20min，无菌水冲洗4～6次，然后接种到诱导培养基上进行诱导培养,接种后先在25～28℃条件下全暗培养20～30天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为1500～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养起直至形成愈伤组织；（2）增殖培养：挑选状态较为一致的愈伤组织接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养7～14天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为1500～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养，15～20天转接一次；（3）液体培养：选取疏松易碎、有金属光泽、生长旺盛的胚性愈伤组织用镊子夹碎后接种于液体培养基中在转速为100～150r/min，光照强度为800～1200lx，培养温度为25～28℃的条件下进行振荡培养；（4）悬浮细胞系建立：用40～50目的过滤筛对悬浮初期培养物进行过滤，以除去大细胞团，保留分散程度好的小细胞及单细胞，按1:3～1:2的体积转入新鲜培养液，悬浮培养周期为6～9天，多次继代建立悬浮细胞系。