[发明专利]一种耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法和应用

摘要

一种耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法和应用。首先筛选出高效氨氧化细菌，对其进行耐盐和耐冷性驯化得到被驯化的Ochrobactrum.sp和Aquamicrobium.sp，再将制备好的生物炭球置于耐盐耐冷氨氧化细菌富集液中对生物炭球挂膜后与耐盐耐冷氨氧化细菌包埋混合液混合，最后将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液后放置冰箱交联、清洗，得到耐盐耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球。显然本发明利用生物炭球为载体固定化耐盐耐冷氨氧化细菌，载体材料因地制宜来源广泛，制法简单，易于产业化，耐盐耐冷氨氧化细菌固定化的生物炭球应用于低温高盐的氨氮污染水体净化，微生物量大，机械强度高，处理效果好，费用低，无需回收，且对环境也不会造成二次污染。

主权项

1.一种以生物炭球为载体的耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法，其特征是首先筛选出高效氨氧化细菌，然后对氨氧化细菌进行耐盐和耐冷性驯化得到耐盐耐冷氨氧化细菌，其次将制得的数个生物炭球置于耐盐耐冷氨氧化细菌富集液中得到挂膜生物炭球，再将所述挂膜生物炭球置于与耐盐耐冷氨氧化细菌包埋混合液中并从中取出再逐粒放入饱和硼酸溶液中，最后，将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液中，并放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球；上述高效氨氧化细菌的筛选方法，包括如下步骤：（1）富集培养：称取干重10g-20g的沉积物，加入到一个盛有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个富集培养基中，于所述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化细菌的浓度，最终得到氨氧化细菌富集液；上述富集培养基为：(NH4)2SO4 5.5g，CaCO3 5.5g，NaCl2.0g，MgSO4 0.5g，K2HPO4 1.5g，MnSO4 0.01g，FeSO4 0.02g，蒸馏水1000mL，5%Na2CO3调节pH=8.0，121℃灭菌30min；（2）纯化分离：将所述氨氧化菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于28℃-30℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种氨氧化细菌，上述培养基为：NH4SO4 2g，NaH2PO4 0.25g，MgSO4·7 H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.01g，K2HPO40.75g，NaCl 0.01g，CaCO3 5g，琼脂 20g蒸馏水1000mL，5%Na2CO3调节pH=7.2，121℃灭菌30min；上述氨氧化细菌的耐盐和耐冷性驯化方法，包括如下步骤：（1）耐盐性驯化：将所述分离得到多株纯种氨氧化细菌挑取到一个富集培养基中于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天，分别得到单菌株富集液，待所述各单菌株富集液进入对数增长期时，以各单菌株富集液与富集培养基5%的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的氨氧化细菌即为耐盐氨氧化细菌；（2）耐冷性驯化：将所述筛选出的耐盐氨氧化细菌以富集液与富集培养基5%的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min-180r/min的条件下震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的氨氧化细菌即为耐盐耐冷氨氧化细菌；上述生物炭球挂膜方法：将生物炭球置于所述耐盐耐冷氨氧化细菌富集液中浸泡4-6天，得到挂膜生物炭球；所述的包埋混合液是10%聚乙烯醇的水溶液和20%的湿菌体按体积（10-15）：1的比例混合得到的，所述湿菌体是取50ml-100ml的微生物富集液经5000-8000r/min离心10-15min,去除上清液后用无菌水清洗若干次次后得到的；上述生物炭球的制备方法，包括如下步骤：（1）取秸秆洗净，烘干至恒重，将秸秆粉碎后过筛得到秸秆粉末，经过马弗炉烧制成生物炭；（2）将所述烧制的生物炭用去离子水清洗若干次，并利用0.1mol/L的硝酸作为改性剂，在200r/min的磁力搅拌条件下，使上述改性剂与生物炭充分混匀，进行改性一天后，再用去离子水清洗至pH为中性得到化学改性生物炭；再将所述的化学改性生物炭置于频率40Hz的微波清洗仪中微波震荡40min-90min，过滤，恒温干燥后得到物化改性生物炭；（3）再将粘土在恒温干燥箱中干燥，过100目-200目筛得到粘土粉末；（4）将所述物化改性的生物炭与粘土粉末按质量比为（0.5-1）：10的比例混合后，加入到硅酸钠和碳酸氢钠用去离子水溶解的混合液中，用制球机制成球粒后，再置于恒温干燥箱中干燥，最后置于马弗炉烧制成生物炭球，所述硅酸钠与粘土质量比为3%，碳酸氢钠与粘土质量比为1.5%；上述马弗炉的烧制条件皆为：升温速度10℃/min, 温度为300℃-400℃和保温时间180min，恒温干燥条件皆为60℃-80℃条件下干燥8h-12h 。